Комплексы Cu(II) с дегидратированной спиральной ДНК

Карасев В.Е. (chemi@online.ru ), Бабий А.П. Институт химии ДВО РАН, г. Владивосток

Известно, что ионы металлов являются обязательными структурными компонентами нуклеиновых кислот, обеспечивая их нормальное функционирование [1]. Соединения меди (II), воздействуя на организм, обнаруживают мутагенную, канцерогенную и онкостатическую активность, что, в первую очередь, связывают с их способностью взаимодействовать с ДНК.

Для изучения процесса комплексообразования меди (II) с нативной ДНК (нДНК) в водно-солевых растворах, привлекались, преимущественно, методы дифференциальной УФ спектроскопии (ДУФС), кругового дихроизма (КД), реже - ИК спектроскопии, которые позволили получить данные о константах устойчивости, природе донорных атомов, конформационном состоянии биополимера в образующихся комплексах меди (II) с нДНК [2].

Молекула ДНК, представляющая собой полиэлектролит, сильно и неравномерно гидратирована. Степень гидратации имеет определяющее значение для ее конформации: при высокой степени гидратации ДНК находится в В форме, уменьшение степени гидратации приводит к переходу ДНК из В в С, А или (если позволяет нуклеотидная последовательность) в Z формы [3]. С позиции биокоординационной химии представляет интерес изучение изменения строения ближайшей координационной сферы, характера химической связи при конформационных перестройках биополимера в комплексе Cu (П)*нДНК. По существу, ион меди (II), связанный в комплексе, можно рассматривать как биозонд,

позволяющий сделать соответствующие выводы о структурной перестройке биолиганда под воздействием внешних факторов.

В работе исследовано строение, природа химической связи в комплексе меди (II) с дегидратированной А-конформационной формой нДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Для получения комплекса Cu (II) c нДНК использовали ДНК из морской звезды Asterias amurensis. Содержание гуанин-цитозин (GC) пар - 41%, белка не более 1%. Сохранность спиральной структуры подтверждена следующими показателями: Тпл.=85,3оС, ДТ=Т1°С, h=39%, где Тпл. - температура плавления, ДТ - интервал плавления, h - гипохромный эффект при термической деспирализации ДНК на длине волны 260 нм в 0,15 М растворе хлористого натрия. ДНК дополнительно очищали от примесей металлов двухсуточным диализом против 10 мМ NaCl и 10мМ Na2 ЭДТА. Затем, против 10мМ NaCl. В работе использовали соли натрия и меди (II) марки ОСЧ. Концентрацию меди (II) и натрия определяли атомно-абсорбционным методом на спектрометре AA 78 фирмы Nippon Jarrell Ash .

Спектры ЭПР снимали на спектрометре Bruker 200tt в трехсантиметровом диапазоне длин волн при 77 К. Электронные спектры поглощения регистрировали на спектрометре Шимадзу 3400. ИК-спектры полученных соединений регистрировали на спектрометре Perkin-Elmer, используя флюоритовые подложки.

Комплекс Cu(II) с нДНК получали смешиванием охлажденных растворов CuCl2 и нДНК, содержащими 1 мМ NaCl. Молярную концентрацию нДНК в концентрированных растворах биополимера контролировали определением фосфора в заданном объеме [4]. К 10 мл раствора 0,06 М нДНК по фосфору приливали 2 мл 0,03 М

раствора CuCl2 . Раствор, содержащий 0,001М NaCl + 0.05М нДНК + 0,005М CuCl2 осторожно перемешивали, выдерживали в течение 48 часов при 4оС и высушивали в вакуум-эксикаторе над P2O5. Полученные пленки ДНК промывали 70% этиловым спиртом, содержащим 1мМ NaCl, затем 96% этиловым спиртом и повторно высушивали над P2O5. Проведен элементный анализ, как полученного соединения, так и дегидратированного биолиганда. Найдено,%: для дегидратированной ДНК N 14.6, P 8.73, Na 5.07, Н2О 2.00; для соединения Cu(II) с нДНК N 13.9, P 8.33, Na 3.84, Cu 1.67, Н2О 5.80. Это позволяет дегидратированный биолиганд и полученное соединение представить формулами : [А10№72]4Н2О и [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О, где А -нуклеотид в составе биополимера. Содержание воды определяли весовым методом и методом ИК спектроскопии [5] . В полученном соединении сохраняется спиральная структура биолиганда, о чем свидетельствуют величины Тпл. и h%, равные 84,1 оС и 38 соответственно, при его повторном растворении в 0,15М растворе хлористого натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Инфракрасный спектр соединения [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О представлен на рис.1. Поскольку в полученном соединении один координированный атом меди приходится на ~ 10 мономеров биополимера, спектр полученного соединения практически не отличается от спектра дегидратированной находящейся в А конформации нДНК. Известно, что отличие А и В конформации ДНК достаточно хорошо проявляется в области колебаний сахаро-фосфатного остова (950-1300 см -1) [6]. В спектре комплекса [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О наблюдается характерное для А формы Vas (PO2-)= 1235 см-1 колебание и наличие полосы 1183 см-1 , тогда как для В формы характерно Vas (PO2-)=1224 см-1 и отсутствие полосы

1183 см-1 , обусловленной резонансным расщеплением антисимметричных колебаний фосфатных групп. Отношение интенсивности полос 1086 см-1 / 1235 см-1 = 2,0 +/- 0,2 в полученном соединении, является характерным для А формы биополимера [7].

Т-1-1-1-1-1-

1БОО 1600 1200 1000 BOOsm-l

Рис.1. ИК спектр соединения [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О.

Для комплекса [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О спектр ЭПР, при 77К, представлен сигналом изолированных ионов меди (II) c аксиальной анизотропией g-факторов с параметрами: g=2.316, A=160 э, g± =2.050 (рис.2). Известно, что величина g уменьшается по мере замещения атомов кислорода на атомы азота в первой координационной сфере меди в порядке CuO4 > CuO3N > CuO2N2 > CuON3 > CuN4, тогда как для величины Ац это изменение имеет обратный порядок [8,9]. Определены пределы изменения при различном количестве координационных атомов азота в плоскости металла [9]. Сравнение полученных нами величин параметров g и А| с литературными данными [8-10] позволяет считать, что экваториальную плоскость комплекса Cu (II) нДНК образуют два атома азота и два атома кислорода.

Рис.2. Спектр ЭПР соединения [Cu0.97A10Na6.2] 12Н2О.

Оценка параметра а2 характеризующего степень ковалентности связи Cu (II) - лиганд (а =0.86) в соединении [Cu0.97A10Na6.2] 12Н2О, свидетельствует о преимущественно ионном характере взаимодействия в комплексе. Расчет а2 проводили по формуле, предложенной в работе [11].

а2=Ацф + (gn - 2.0023) + 3/7 (g± - 2.0023) + 0.04, где p=370 э для комплексов меди.

В электронном спектре соединения [Cu0.97A10Na6.2] 12Н2О в интервале 585-1050 нм наблюдается широкая асимметричная полоса поглощения с Xmax=690 нм (рис.3). На низкочастотной стороне поглощения обнаруживаются плечи с Х=811 и 925 нм. Положение максимума полосы поглощения в электронном спектре комплекса Cu (II) нДНК также подтверждает экваториальную координацию двух атомов азота вокруг центрального атома [12]. Выявленная сложная структура спектра может быть объяснена только с учетом искажения октаэдрической симметрии, в том числе, и вполне вытянутой бипирамиды симметрии D4h - наиболее устойчивой конфигурации шестикоординированных комплексов меди (II) [13]. С учетом тетрагонально расщепленных, для симметрии D4h, уровней:

2 2 2 2 2 2

Eg= B1g + A1g и T2g = B2g + Eg нами сделано следующее отнесение

2 2 -1 2 2

экспериментальных полос А^<- B1g (10800 см ), B2g- B1g (12300 см-1) и 2Eg-2B1g (14500 см-1).

-i-1-i-

Рис.3. Электронный спектр поглощения комплекса [Cuo.97AloNа6.2] 12Н2О.

На основании соотношения для тетрагональных компонентов уровней 2B1g (-6Dg - 2Ds + Dt) 2Аlg(6Dg +2Ds + 2Dt) : 2B2g(4Dg - 2Ds + Dt) и Eg(4Dg + Ds - 4Dt) были определены значения 10 Dg и параметры Ds и Dt. Их величины составляют для соединения [Cuo.97AloNа6.2] 12Н2О:

10Dg = 12300 см-1, Ds = 1850 см-1, Dt = 700 см-1.

В наших условиях синтеза, при избытке биолиганда в системе, взаимодействие Cu (II) с нДНК осуществляется с GC-компонентой в составе биолиганда, в частности, с атомом N7 гуанина [3,14,15].

При этом образуются октаэдрические комплексы с донорными атомами кислорода фосфатной группы и молекул воды и атомом азота - N7 [16,17]. Взаимодействие иона Qi (II) с АТ компонентой ДНК в наших условиях представляется маловероятным. Поэтому нами будут рассматриваться только возможные варианты строения

образующихся комплексов Cu (II) с GC парой в составе ДНК. Дегидратация образующегося комплекса

приводит к конформационному переходу ДНК из В->А форму.

Полученные нами экспериментальные данные позволяют предложить строение образующегося комплекса меди (II) с дегидратированной А-формой нДНК.

Рис.5. Предполагаемое строение ближайшей координационной сферы в комплексе Cu(II) дегидратированная А форма ДНК:

б) хугстиновская GC пара.

Среди существующих различных гипотетических моделей комплексов Cu (II) с нДНК полученные нами результаты согласуются с моделью Х.Циммера [18] для В-формы ДНК. Согласно гипотезе Х.Циммера взаимодействие меди (II) с атомом

азота N7G вызывает переход азотистого основания из анти-

конформации, характерной для уотсон-криковской GC пары в син-

[010.97Аю.2]-12Н2О

(n-12)H2O

а) уотсон-криковская GC пара;

конформацию, отвечающую хугстиновскому взаимодействию гуанина с цитозином. При этом ион Cu(II) образует связь с атомами азота N7G и и атомами кислорода и О2С (рис.5).

Образование подобных комплексов Cu (II) с нДНК в растворе было рассмотрено в работах В. А. Сорокина [2,14]. На основании анализа ДУФС автором показана возможность перехода G в син-конформацию при взаимодействии Cu (II) с GC парой в составе нДНК. Следует отметить, что результаты полученные методом ДУФС, позволяют только предположить образование комплексов Х. Циммера , тогда как наши данные, полученные методами электронной, ЭПР спектроскопии дают однозначный ответ о строении и характере химической связи в образующемся комплексе Cu (II) с GC парой спиральной дегидратированной ДНК, находящейся в А-форме.

В наших условиях получения комплекса [Cu0,97A10Nа6,2] 12Н2О при дегидратации биополимера и связанной с ней конформационной перестройке В-формы в А-форму возможно образование комплекса 01(П) с GC компонентой без нарушения комплиментарного уотсон-криковского взаимодействия (рис.5). Экваториальная плоскость центрального атома образована атомами азота N3G и и атомами кислорода и О2С, т.е. хромофор (N2O2ra. как и в модели Х. Циммера [18]. Полученные нами результаты согласуются с обеими моделями взаимодействия Cu (II) с GC парой нДНК. Известно, что комплиментарные пары, как в В- так и в А-форме нДНК не лежат в одной плоскости, а повернуты относительно друг друга как лопасти пропеллера [3]. Поэтому экваториальные донорные атомы и центральный атом не могут лежать в одной плоскости и поэтому ион меди (II) может находиться как выше, так и ниже гипотетической плоскости (рис.5). Это согласуется с данными работы Ларина Г.М. и

др. [19], в которой показано, что геометрия комплексов Cu (II) с координационным узлом (N2O2) и объемными заместителями у атомов азота отклоняется от плоскоквадратурной в сторону тетраэдрической. В нашем случае, это проявляется в увеличении g фактора комплекса [010.97А10Ыа62р12Н2О по сравнению с другими, чисто плоскими, аналогичными хромофорными группами (N2O2).

В работе [20] предложена модель, согласно которой ион меди (II) образует связь с двумя донорными атомами азота N7G и двумя атомами кислорода соседних GC пар одной цепи. Частота

встречаемости этой последовательности для ДНК, содержащей 41% GC пар довольно велика ~10% [21]. Согласно И. Шрайберу взаимодействие Cu (II) с соседними dGC одной цепи должно протекать с образованием тетраэдрической структуры с хромофорной группой (N2O2) [20] .

В полученном соединении [Cu0.97A10Nа6.2] 12Н2О не обнаружено ионов меди (II) с тетраэдрическим окружением, о чем свидетельствуют данные электронной и ЭПР спектроскопии.

Рассмотренные возможные варианты образования комплексов Cu (II) с различными донорными атомами, но с одинаковой хромофорной группой (N2O2) не вступают в противоречие между собой, а могут сосуществовать одновременно.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андроникашвили Э.Л. Биофизика.-1987.-Т.23.-С.782

2. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О., Корнилова С.В., Сорокин В.А., Шкорбатов А.Г. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наукова думка.-1991.-270с.

3. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых

кислот. М.: Мир.-1987.-584с.

4. Химия и биохимия нуклеиновых кислот.Л.:Медицина-1968.-79с.

5. Семенов М. А. ИК-спектроскопическое проявление гидратации и конформационное состояние ДНК. Препринт ИРЭ АН УССР.- 1980.-

6. Sukhorukov B.J., Montrel M.M. Biophys. Chem.-1990.-V.35.-P.47.

7. Монтрель М.М., Сухоруков Б.И. Молекуляр. Биол.-1989.- Т.23, №3.-С.699.

8. Вышневская Г.П., Молочников Л.С., Сафин Р.Ш., Балакин С.М. Высокомолекулярные соед.-1982.-Т.24, №3.-С.611.

9. Barbucci R., Campbell M. J. Mol. Chim. Arta.-1976.-V.14, N1.-

P.113.

10. Молочников Л.С., Ильичев С.А., Балакин С.М., Вишневская Г.П., Сафин Р.Ш. Коорд. Химия .-1988.-Т.14, №10-С.1345.

11. Kivelson D., Neiman R. J. Chem. Phys.-1961.-V.35.-P.149.

12. Волченскова И.И. Теоретич. и эксперим. Химия.-1973.-Т.9, №5.- С.627.

13. Больхаузен Х. Введение в теорию поля лигандов.- М.:Мир.-

1969.-С.360.

14. Сорокин В.А. Биофизика.-1994.-Т.39.-С.993.

15. Fruster W., Bauer E., Schutz H. et al. Biopolymers .-1979.-V.18,

N3.-P.625.

16. Яцимирский К.Б., Бабий А.П., Машковцев Р.И. Теоретич. и эксперим. химия.- 1984.-Т.20, №1.-С.107.

17. Kulikov A.P., Baby A.P., Vuriev G.C. Nucl. Instrum. Meth. Phys. Res.-1987.-A.261.-P.185.

18. Zimmer Ch. Z. Chem. -1971- V.11.-S.441.

19. Ларин Г.М., Колосов В.А., Панова Г.В., Викулова Н.К. Журн.

Неорган. Химии.-1973.-Т.18.-С.2268.

20. Richard H., Schreiber J.P., Daune M. Biopolymers.-1973.- V.12, N1.-P.1.