Использование клеточного биосенсора Spirostomum ambigua для характеристики биологической активности компонентов

фармацевтических препаратов

Быканова С.Н.(1), Суздалева О.С.(1), Серегина О.Б.(2), Ковалева А.А.(1), Комиссарова И.А.(3), Плетенева Т.В.(1), Сыроешкин А.В. (antonvs@mail333.com) (4)

(1) Кафедра фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов (РУДН); (2) ГНИИ Биоэффект ; (3) МНПК Биотики ; (4) Лаборатория прикладной гидрохимии и аналитической химии ГОИН

Росгидромета

Диаграммы Доза-Ответ (концентрация-время жизни) и зависимости времени жизни свободноживущей инфузории S. ambigua от температуры использованы для характеристики биологической активности компонентов фармацевтических препаратов при индивидуальном и комбинированном действии, в том числе и со вспомогательными веществами. Определены параметры взаимодействия S. ambigua с рядом соединений (некоторыми аминокислотами, лекарственным препаратом MP-33 на основе аминокислот, ионами цинка, бихромат-ионами, сульфаниламидными препаратами, противолейкозными препаратами, минеральными водами) в двухстадийной кинетической схеме, включающей быстрое образование промежуточного состояния клетки с последующим медленным (минуты-часы) переходом в неподвижное, нереактивное состояние (гибели) по закону аррениусовской кинетики. Показано, что энергия активации (Ea) стадии этого медленного перехода S. ambigua является инвариантным (по отношению к состоянию клеток) параметром, находящимся во взаимно однозначном соответствии с природой химического соединения или фармацевтического препарата. Обсуждается смысл Ea для клеточных переходов по аналогии со структурными перестройками мембранных олигомерных ферментов и применимости аналогичных кинетических схем лиганд-индуцированных клеточных переходов для описания ряда сложных процессов (возникновения лекарственной устойчивости, эффективности химиотерапии, апоптоза). Продемонстрированы различные варианты нарушения аррениусовской зависимости при комбинированном действии компонентов фармацевтических препаратов и использования этих данных, как и параметров двухстадийных клеточных переходов, для оптимизации начальных стадий разработки новых лекарственных средств.

1. Характеристика Spirostomum ambigua

Методология использования простейших для оценки биологической активности химических разработана на основе изучения кинетики токсических воздействий [1-8]. Оценка

биологической активности токсикантов с использованием клеточных культур или простейших организмов имеет ряд преимуществ перед использованием лабораторных животных (млекопитающих). Во-первых, снимаются целый ряд проблем этического характера. Во-вторых, одноклеточные организмы способны обеспечить получение обширной информации при относительной небольших материальных и финансовых затратах, и могут использоваться как базовые модели для оценки токсической активности. Кроме того, при работе с такими объектами упрощается трактовка физиологических проявлений токсических воздействий через выявления механизмов на субклеточном и надмолекулярном уровнях. Для изучения токсичности неорганических соединений исторически на фармацевтическом факультете ММА им. И.М. Сеченова использовали инфузорию P. caudatum [7]. Для исследования водных растворов сложного состава (в том числе содержащих высокомолекулярные соединения, поверхностно-активные вещества), предпочтительнее использовать свободноживущие в объемной фазе простейшие, не зависящие от свойств раздела вода-дно. Такой организм - Spirostomum ambigua -широко применяется как тест-культура для токсикологических и фармакологических исследований [9-13].

Spirostomum ambigua O.F.MUller, 1786 - одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротроф-детритофаг, часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзо-вентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1:10, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженным, клетка даёт мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры [14]. При благоприятных условиях характеризуется высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении. В ГНИИ Биоэффект постоянно поддерживается в культуре штамм S. ambigua (штамм проф. Леонидова). Клетки S. ambigua в благоприятных условиях (слабоминерализованная среда культивирования или дистиллированная вода, 19оС - 29оС) не гибнут в течении времени, превышающем клеточный цикл (~20 часов). При внесении в среду определенных химических веществ погибают в течении интервала времени, являющегося функцией как концентрации, так и температуры [15-18]. Время жизни клетки рассчитывается как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатируется, либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Относительная ошибка измерения времени жизни не превышает 15-20%. Гибели клетки предшествует формирование промежуточного состояния (описанного ниже, с изменением морфометрических характеристик,

obsfm = - (1)

и оптических свойств, зернистости цитоплазмы) а также целый комплекс специфических поведенческих реакций. В норме, S. ambigua совершает свободное передвижения в толще раствора с характерным чередованием сжатия/вытягивания клетки. В среде, содержащей компоненты фармацевтических препаратов, такое передвижение может сопровождаться конвульсивными подергиваниями, фиксацией около стенки ячейки, прецессионными движениями и другими характерными отклонениями от нормального плавания в трехмерной среде. Ряд особенностей формирования промежуточного состояния и изменения поведенческих реакций будут доступны в виде фильма в формате mpeg4 на сайте www.oceanography.ru с 20.05.2003.

2. Кинетика лиганд-индуцируемых клеточных переходов S. ambigua

Для описания кинетики развития клеточных популяции под действием ингибиторов и промоторов, при культивировании в ферментерах, при развитии раковых опухолей [19-22] успешно используется аппарат химической кинетики. С нашей точки зрения основа удачного применения квазихимических моделей состоит в адекватности представлений клетки как полиферментного химического реактора. В соответствии с этим деление клетки или ее гибель есть интегральное отражение усиления или прекращения тех или иных ферментативных химических процессов. В предыдущих работах [15-18] мы обосновали возможность такого подхода, как теоретически, так и при исследовании лиганд-индуцируемой кинетики гибели инфузорий. Для S. ambigua обнаружено образование в процессе лиганд-индуцируемой гибели промежуточного состояния, эквивалентного комплексу фермента с субстратами/продуктами реакции. Особенностью этой схемы является тот факт, что клеточные переходы вызываются лигандами самого различного происхождения, как заведомо токсичными соединениями (например, бихромат калия), так и природными метаболитами (например, глицин). Кинетическая схема взаимодействия лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua имеет следующий вид [18]:

быстро fm, медленно

С (cell)+nL -CLn *T)C (мертвая клетка) (с1)

Решение этой схемы для наблюдаемой константы скорости образования устойчивой формы идентично уравнению Хилла или кинетической схеме, где первая стадия соотвествует адсорбции Френдлиха:

1 + -

А выражение для времени жизни будет иметь следующий вид: 1 + -

Tl = (2),

Промежуточное состояние хорошо идентифицируется на размерных спектрах тест-культуры [16, 23], полученных с помощью малоуглового измерителя дисперсности (particle sizer) [24]:

Рисунок 1. Действие токсикантов на формообразование (А) и кинетику гибели (В) инфузории S. ambigua. Кривые объемного распределения культуры клеток были получены с помощью лазерного дифракционного определителя размеров частиц (particle sizer) Malvern 3600 Ec: белые кружки соответствуют контрольной культуре в отсутствии токсикантов (общее число клеток - 1000, концентрация 100 клеток / мл); концентрации токсикантов - 5% ДМСО (черные кружки), 20 мМ сульфаметаксазол (черные квадраты). Ось ординат-линейные размеры ширины клеток S. ambigua. Кинетику гибели исследовали для сульфаметаксазола. Все исследования проведены при 20 оС.

10 100

Размер клеток,(г) мкм

Данные статистической морфометрии подтверждаются и при микроскопическом исследовании, позволяющем визуально идентифицировать промежуточное состояние (рис. 2). Низкомолекулярные лигандов - компонентов фармацевтических препаратов приводят, в основном, к истоньшению клетки, как показано на рис. 2. Для некоторых соединений возможны и иные морфометрические изменения, например, в 2% растворе тяжелой воды S. ambigua приобретает колбообразную форму.

При микроскопическом исследовании возможно выделение нескольких промежуточных

1 z.

Рисунок 2. S. ambigua. Общий вид исходного организма и. лиганд-индуцированное переходное состояние, соответствующие двум максимума размерного спектра (рис. 1) .

состояний при лиганд-индуцированной гибели. Количественно кинетику гибели можно описать на основании минимальной кинетической схемы (с1 ) (и соответствующего ей уравнения (2) или более сложных аналогичных кинетических схем. Выделение на схеме (с1) быстрой стадии связывания лиганда и медленной стадии клеточного перехода составляют для изученных лигандов секунды и десятки минут, соответственно. Однако возможно более медленное протекание стадий связывания лиганда (при сохранении соотношения длительности первой и второй стадии). Так, например, в 1,5 % растворе поливинилпирролидона наблюдаются осцилляции S. ambigua из исходного в промежуточное состояние с интервалами времени прямого перехода около 5 мин., а обратного 20 мин. (при 25 оС).

В практике исследования токсичности широко применяются диаграммы Доза-Ответ [25]. При характеристике биологической активности химических соединений с использованием кинетика клеточных переходов S. ambigua в качестве данных диаграмм как экспресс характеристики токсичности химического соединения могут служить зависимости Концентрация-время жизни (рис. 3, а также [17]).

сульфацил, мМ стльфомет^сисш, мм DO %

2 этанол, %

Рисунок 3. Примеры диаграмм Доза-Ответ (концентрация - время жизни S. ambigua.

При фиксированной температуре можно получить линеаризованные зависимости tl от L-n при итерационном подборе параметра n, который может варьировать от 1 (рис. 4) до 9 [17].

Отклонения от такой простейшей линеаризации диаграмм Доза-Ответ являются тестом для уточнения кинетического механизма взаимодействия тест-объекта с лигандом. Графически это выражается либо в смещение линеаризованной зависимости и пересечении ее с осью ординат при отрицательных значениях или появления бифазных зависимостей (например, для этанола). Действительно, малейшее усложнение кинетической схемы (с1), как-то введение второго пути связывания лиганда (2Kp) со стехиометрией b и соответствующего ему процесса гибели с вероятностью fm приводит к следующему виду уравнения для времени жизни:

1 (Ln +Kp) (Lb+2Kp)

Tl = , где a= 2fm / fm (3),

fm Ln(Lb + 2Kp) + a Lb (Ln+Kp)

Уравнение (3) даже при значительных упрощениях не дает возможности определения всех параметров без длительного кинетического исследования. Оказалось, что наиболее информативной биологически активного действия химических соединений являются аррениусовские характеристики кинетики гибели.

Было обнаружено [15-18], что при лиганд-индуцированных клеточных переходах зависимость времени жизни S. ambigua от температуры линеаризуется в аррениусовских координатах, как показано на рис. 5. Наблюдаемая величина энергии активации (Ea) для глицина практически не зависела от концентрации в интервале от 60 до 250 мМ. Это связано либо с низким значением Kp в уравнении (2), либо с высоким значением n, что отражает высокое сродство и кооперативность к естественному лиганду, принимающему участие в метаболических процессах. Это положение является верным и для ряда других аминокислот,

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 [Gly], M

20 24 28 32

t, °C

Рисунок 5. Кинеткиа глицин-индуцируемых клеточных

переходов S. ambigua А. Концентрационная зависимость времени жизни в растворе глицина. В. Зависимость времени жизни S. ambigua от температуры в прямых (В) и аррениусовских координатах (С) при инкубации инфузории в 0, 125 М глицине. Используемый интервал температур от 19 С до 31 С.

3,28 3,36 3,44

1000/T, к1

j 15

их комбинаций, малотоксичных микроэлементов (Zn), минеральных вод (см. ниже). При этом, токсичные неприродные (например, бихромат калия, диметилсудьфоксид - рис. 7 и [17]) соединения демонстрируют сильную зависимость кажущейся энергии активации от концентрации токсиканта.

Рис. 7. Зависисмость кажущейся энергии активации кинетики гибели S. ambigua от концентрации токсиканта. Пример определения истинной энергии активаци приведен в работе [17].

5 6 7 8 9 10 0,00 0,02 0,04 0,0б 0,08 0,10

ДМСО, % К2Сг207, М

Параметр истинной энергии активации лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua, рассчитываемый из аррениусовской линеаризации кинетики гибели, зависит от вида химического соединения м. рис. 7 и [18]). Тот факт, что все эти вещества приводят к гибели инфузории легко объяснить, приняв, что повышение температуры является фактором, ускоряющим естественную гибель клетки по причине сильной зависимости ее сократимости от температуры [14].

ч о

200 150

100 50

цинка сульфат треонин ДМСО глицин глутумат аланин

Кажущееся бессмертие простейших обусловлено, по-видимому, тем, что потенциальное время жизни клетки намного больше времени деления. Низкомолекулярный лиганд фактически катализирует процесс гибели, ускоряя его до лабораторно регистрируемых времен. Именно при таком рассмотрении схема с1 близка по смыслу к схемам лиганд-зависимой инактивации фермента, а энергия активации является параметром, отражающим условия промотирования или катализа процесса гибели клетки. При значительных (по сравнению с ПДК для пресноводных водоемов) концентраций Zn2+ очевидно должно приводить к гибели клетки по типу некроза. Отсюда следует предположить, что параметр Ea может служить количественным критерием при необходимости дискриминировать апоптозный и некрозный тип процесса. Величина Ea характеризует интенсивность перестроек клеточных структур, индуцированных определенным лигандом. Из электрохимической кинетики хорошо известно, что процессы разряжения электроактивных частиц имеют Еа<10 кДж/моль при условии контролирования диффузии. Процессы, контролируемые кинетикой, т.е. зависящие от механизма реакции, имеют Еа>10 кДж/моль. Нами описана возможность кинетического представления клеточных превращений с использованием схем ферментативной кинетики, в которых клетка описывается как полиферментный реактор [23]. Медленность второй стадии лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua у и высокие значения энергии активации указывают на явление значительных конформационных перестроек подобных медленным конформационным переходом олигомерных мембранных ферментов из деактивированного в активное состояние [27, 28].

Рис. 8. Зависимость энергии - активации лиганд-индуцируемой гибели S. ambigua от природы низкомолекулярного соединения.

3. Изучение неаддитивных эффектов при комбинированном действии компонентов фармпрепаратов

Кинетическая схема (с1 ) может описывать действие и многокомпонентных фармацевтических препаратов при условии, что после взаимодействия с лигандами возникает одно промежуточное (предсмертное) состояние - C*:

C + L1

Схема с2 может быть хорошо проиллюстрирована при описании движении пробной точки в 2-D потенциальном поле [29]. Нам удалось описать по такой схеме ряд многокомпонентных лекарственных препаратов (препараты, применяемые для лечения острых лейкозов у детей, лечебные и лечебно-столовые минеральные воды), которые демонстрируют простейшую аррениусовскую зависимость кинетики гибели, что и указывает на однонаправленность биологического действия (табл. 1) составляющих эти препараты компоненты. Нарушения же аррениусовской кинетики можно интерпретировать как возникновение, как минимум, двух типов промежуточного состояния (C1* и C2* на схеме с3) с разными константами скорости гибели 1fm и

2fm.

C + L1 C +L2

CL1 CL2

Кинетическая схема с3 предполагает нарушения аррениусовской зависимости (рис. 9). Вид нарушения аррениусовской зависимости (нелинейность в координатах ln(1/tL) от (1/T), число

2,52,0-

I 1,5 ё

0,5 0,0

Рис. 9 Отклонение от аррениусовской зависимости кинетики гибели S. ambigua при комбинированном действии ДМСО и сульфалена. Пунктиром показана экспоненциальная кривая при ДМСО-индуцированной гибели (концентрация - 10%).

18 20 22 24 26

t, °С

Зависимость времени жизни S. ambigua от температуры при комбинрованном действии глицина и ионов цинка, [Zn2+/t:[Gly/t=1:10

-4,8

-5,2

-5,6

-6,0

-6,4

-6,8

3,30 3,32 3,34 3,36 3,38 3,40 3,42 1000/T, K

20 22 24 26 28 30 32 34

t, oC

Рис. 10. Температурная зависимость кинетики комбинированного действия глицина и сульфата цинка на S. ambigua. На правом графике - линеаризация начального участка зависимости.

цинка будет дополнительно усиливать неспецифическую резистентность и адаптационные свойства клеток человека, помимо уже известных фармакологических свойств этих субстанций, применяемых по отдельности в составе препаратов Глицин производства МНПК Биотики и Цинкит зарубежного производства.

Вид неаддитивных эффекты при комбинированном действии возможно определить при использовании упомянутых выше диаграмм Доза-Ответ . Классическим примером синергического противомикробного действия является препарат Бисептол , включающий в качестве действующих субстанций сульфаметаксазол и триметаприм. На рис. 11 продемонстрирован синергический эффект, выражающийся в неаддитивном уменьшении времени жизни S. ambigua при комбинированном действии указанных субстанций.

перегибов может служить тестом на одно- или разнонаправленность механизмов действия компонентов фармацевтических препаратов, также как эти данные используются в энзимологии мембранных ферментов [30]. На рис. 10 приведен пример обнаружение сильного антагонистического эффекта при комбинированном действии глицина и ионов цинка. Начальный участок (вставка на левом графике рис. 10) подчиняется аррениусовской зависимости и может быть описан по схеме с1, где в качестве лиганда выступает комплекс глицина с ионами цинка (концентрации свободных глицина и Zn2+ подобраны так, что не оказывают действия на тест-объект). После достижения значений температуры в 29 оС начинается триггерное усиление выживаемости S. ambigua, проявляющееся в многократном увеличении продолжительности жизни клеток. Следует ожидать, что применение комбинированного препарата глицина и солей