Популярное

Мифы о звукоизоляции



Как построить дом из пеноблоков



Как построить лестницы на садовом участке



Подбираем краску для ремонта



Каркасные дома из дерева


Главная » Дыхательный тест

1 2

13С-уреазный дыхательный тест на базе прецизионной изотопной масс-спектрометрии

Веливецкая Т.А. (Velivetskaya@mail.ru), Игнатьев А.В. Дальневосточный геологический институт ДВО РАН

Введение. В настоящее время интенсивно развивающиеся изотопные методы получили общее признание в области научной и практической медицины. Многие современные методы клинической диагностики и фармологических исследований основаны на применении меченых изотопов. Использование меченых изотопов является в отдельных случаях единственно возможным методом экспериментального исследования проблем, связанных с изучением динамики процессов и путей превращения химических веществ в живом организме. До недавних пор, исследование ряда механизмов функционирования различных органов и систем проводилось в основном с применением радиоактивных изотопов водорода, углерода, фосфора, калия и других элементов. Высокая чувствительность и точность радиоактивных измерений позволяют применять малые количества радиоактивных изотопов. Тем не менее, радиационное воздействие на организм является источником потенциального риска для здоровья человека. Радиационное воздействие недопустимо в диагностических процедурах для беременных женщин, младенцев и детей. В последние годы значительное внимание уделяется методам с применением стабильных изотопов. Преимущество использования стабильных изотопов вполне очевидно - это их полная безопасность, они не радиоактивны и не токсичны [ 1, 2]. Интенсивное внедрение методов стабильных изотопов в практическую медицину стимулировано высоким уровнем современного развития и совершенствования изотопной масс-спектрометрической техники для измерения стабильных изотопов и развитием технологий по производству препаратов, обогащенных стабильными изотопами. Благодаря высокому уровню чувствительности современной аналитической техники для проведения клинических исследований достаточно очень малого количества препарата, меченного стабильными изотопами. Применяемые дозы препаратов сопоставимы по



содержанию стабильных изотопов с поступлением их в организм естественным путем вместе с пищей, водой, воздухом [3]. Кроме того, стабильные изотопы имеют еще одно немаловажное преимущество перед радиоактивными изотопами. Время жизни радиоактивных изотопов мало, по сравнению с некоторыми биологическими процессами протекающими в организме (период полураспада азота -10 мин, кислорода - 124 с), поэтому использовать их в качестве трассеров очень сложно. С помощью стабильных изотопов кислорода [4], азота [5] и др., возможно изучать длительные во времени процессы, дифференцировать механизмы различных превращений веществ в организме, динамику метаболических процессов, распад и синтез различных соединений, участвующих в непрерывном химическом взаимодействии.

Уникальные возможности методов стабильных изотопов позволяют проводить диагностические исследования с высокой достоверностью и получать количественные данные с необходимой точностью, что выгодно отличает их от традиционных методов медицины. В частности, это касается диагностики экзокринной недостаточности поджелудочной железы и последующей коррекции энзимного обмена [6], определения энзимной функции печени [7], активности окисления жирных кислот [8], диагностики заболеваний желудка, тонкой и толстой кишки [9, 10]. В настоящее время существует более 20 видов изотопно обогащенных препаратов, применяемых в диагностике различных заболеваний человека. Препараты имеют в качестве метки природные стабильные изотопы различных элементов - водород, углерод, азот, кислород. Применяемые в диагностических методах дозировки различных изотопно-меченых препаратов безопасны для здоровья.

В последние годы разработан новый метод диагностики инфицированности человека бактериями Helicobacter pylori [11]. Наличие бактерий диагностируют с помощью вещества (мочевина), обогащенного

изотопом С. Фермент уреаза, вырабатываемый бактериями Helicobacter pylori, катализирует гидролиз мочевины до СО2, NH3 и Н2О. В результате разложения

С-обогащенной мочевины и последующего метаболизма, выдыхаемый

углекислый газ обогащается тяжелым изотопом углерода. Оценка степени С-обогащения СО2 позволяет диагностировать степень инфицированности.



Стабильные изотопы углерода и их измерение.

1. Стабильные изотопы. Одним из наиболее распространенных и важнейших элементов биосферы является углерод. Углерод имеет два

12 13

стабильных изотопа с массовым числом 12 (12С) и массовым числом 13 (13С). В природе средняя распространенность 12С составляет 98,89%,

распространенность С составляет 1 ,11 %. В среднем природное изотопное

13 12

отношение С/ Ссоставляет 0,011. Распространенность стабильных изотопов не является постоянной величиной и имеет вариации в различных природных объектах. Вариации возникают вследствие перераспределения (фракционирования) изотопов в результате физических, химических и биологических процессов. Причиной фракционирования является различие изотопов по массам. Различие изотопов по массам обуславливает различие термодинамических свойств молекул, в состав которых входят различные изотопы элементов [12]. Например, связи, образованные легким изотопом, менее прочны и поэтому молекула, содержащая легкий изотоп, более реакционно способна по отношению к аналогичной молекуле, имеющей в своей структуре тяжелый изотоп [1 3,1 4]. В результате процессов фракционирования вещества могут обогащаться в разной степени легким изотопом или тяжелым изотопом. Например, растения С4 типа (травы пустынь) имеют обогащение тяжелым изотопом углерода в большей степени, чем растения С3 типа (травы умеренной климатической зоны) [1 5]. Обогащение обусловлено кинетическим фракционированием изотопов углерода в процессе фотосинтеза и зависит от механизма фотосинтеза.

Помимо фракционирования, соотношение изотопов в веществе зависит от соотношения изотопов в источнике, из которого образуется вещество. При формировании вещество получает изотопную метку своего источника.

Например, содержание С изотопа в организме человека определяется

поступлением 1 3С-изотопно обогащенных веществ вместе с пищей. Естественное обогащение организма тяжелым изотопом углерода происходит в результате потребления С4-типа растительной пищи с высоким содержанием

изотопа 1 3С. Потребление С3-типа растительной пищи приводит к меньшей степени содержания тяжелого изотопа углерода в организме человека.



Соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 зависит от преобладания С3

или С4 растительной пищи в диете. Содержание С изотопа углерода в организме можно оценить по изотопному составу углекислого газа в выдыхаемом воздухе. Естественное, природное соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 варьирует в диапазоне (1.10 - 1.08)% [16]. Это соотношение может быть изменено, если поступающие в организм вещества имеют изотопное обогащение значительно отличающееся по величине от природного. Препараты с высокой степенью обогащения стабильными изотопами получают искусственным путем. Так, например, в дыхательном тесте для диагностики

инфицированности Helicobacter pylori применяют мочевину, обогащенную С

изотопом. Величина С-обогащения выдоха зависит от дозы и степени изотопного обогащения принимаемого препарата, а также от величины

метаболического продуцирования СО2. В присутствии бактерий мочевина разлагается с выделением изотопно обогащенного углекислого газа. Образование изотопно меченого СО2 является индикатором процесса разложения мочевины, а значит и присутствия Helicobacter pylori бактерий в организме человека.

2. Измерение изотопов. Для определения отношения изотопов в образце (изотопный анализ) необходимы надежные методы и аналитическая техника с высокой чувствительностью и точностью измерения. В настоящее время анализ стабильных изотопов может быть выполнен масс-спектрометрическим методом или спектрофотометрическими методами. Современные масс-спектрометры

1 3 1 2 -8

позволяют измерять изотопное отношение С/ С с точностью 1 0 %.

На практике результаты измерения изотопного состава представляют с помощью величины 8, которая измеряется в промилле.

8 - {(Кобразца / К-стандарта) - 1 }х1°

где Яобразца -относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в образце, Кстандарта - относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в стандарте. Следовательно, при измерении изотопов имеют дело не с абсолютными величинами их отношений, а с относительными отклонениями от изотопного состава стандартного образца. Положительные значения 8 указывают на большее содержание тяжелого изотопа углерода в образце относительно



стандарта, а отрицательные значения на обеднение образца тяжелым изотопом по сравнению со стандартом.

Общепринятым международным стандартом для изотопного анализа углерода является стандарт PDB - кальцит окаменелости Belemnitella americana

13 12

мелового возраста из Южной Каролины. Абсолютное значение 13С/12С отношения в этом стандарте было установлено Крейгом и равно 0.0112372 ат.% [ 1 7]. Со временем этот стандартный материал был исчерпан. Американским национальным бюро стандартов предложен новый стандарт (морской

известняк) NBS19, величина 8 С которого была точно установлена относительно PDB в ряде лабораторий. Основываясь на этих определениях, Международное агенство по атомной энергии в 1 983г. ввело новую шкалу -VPDB. С этого момента изотопный состав углерода образца принято сообщать относительно VPDB.

Масс-спектрометрический метод является на сегодня основным, применительно к дыхательным тестам на основе изотопно меченых препаратов. Изотопный

анализ 1 3СО2 выдыхаемого воздуха этим методом требует предварительной подготовки образца выдоха: разделение СО2 от других газовых компонентов в выдохе. Разделение может быть выполнено с применением криогенной системы очистки, или методом газовой хроматографии. Первую систему пробоподготовки применяют в комбинации с двухканальной системой напуска

13 12

газа в масс-спектрометр, отношение С/ С в образце и стандартном газе измеряют последовательно в цикле из 10 раз. Хроматографический способ разделения используют в сочетании с подключением к масс-спектрометру

интерфейса СсятИо, регистрацию СО2 в образце и стандарте проводят

однократно. Сравнительный анализ измерения выдыхаемого СО2 этими

способами показывает точность определения С-обогащенности СО2 <0.02%о для двухканальной системы напуска газа в масс-спектрометр и <0.14% с применением СопБ1о интерфейса [18]. Применительно к дыхательным тестам требования к аналитическим характеристикам измерительной аппаратуры не столь высоки, удовлетворительная точность измерения изотопного отношения углерода в выдыхаемом воздухе составляет < 0.5%. Этому условию отвечает специализированный прибор BreathMAT (производства Finnigan МАТ, Германия), широко используемый на практике для проведения дыхательных



тестов. Прибор включает в себя систему автоматической подачи и напуска газа для последовательного измерения порядка 200 образцов, систему пробоподготовки образцов методом хроматографии, масс-спектрометрический детектор, систему управления прибором и обработки данных. Прибор обеспечивает высокую производительность и достоверность результатов анализа.

Спектрофотометрические методы измерения изотопного состава являются альтернативными масс-спектрометрии. В отличие от масс-спектрометрии, оптические методы анализа детектируют поглощение электоромагнитных волн молекулами в инфракрасной (ИК) области спектра. Аналитическая техника, основанная на методах молекулярной спектроскопии, существенно дешевле изотопных масс-спектрометров, но уступает в точности измерения изотопного состава. Использование ИК-спектрометров в медицинской диагностике, с применением меченых 1 3С-изотопом препаратов, позволило удешевить и упростить реализацию уреазных дыхательных тестов. Клинические испытания ИК-спектрометрической техники для диагностики Helicobacter pylori инфекции и сравнительный анализ полученных данных с масс-спектрометрическими (МС) исследованиями показывают близкую корреляцию между соответствующими данными тестов [1 9], что отражает равноправность применения ИК и МС техники для определения инфицированности пациентов Helicobacter pylori.

Повышение точности изотопного анализа спектральных методов возможно при использовании лазеров с перестраиваемой частотой. Высокая монохроматичность и мощность лазерного излучения позволяет определять форму спектральных линий с высоким разрешением, повышает чувствительность и точность регистрации спектров. Применительно к диагностике Helicobacter pylori инфекции использование лазерной спектрометрической техники повышает точность изотопного анализа и расширяет диагностические возможности спектральных методов. В частности, применение перестраиваемых диодных лазеров, как источника ИК-излучения, обеспечивает оптимальные условия частоты и мощности излучения лазера для

12 13

одновременной регистрации линий поглощения молекулами СО2 и СО2 с высоким разрешением, что технически упрощает спектральный анализ и



повышает точность определения изотопного отношения углерода в исследуемой газовой среде [20]. Интенсивное развитие методов лазерной спектроскопии способствует созданию аналитических приборов для медицинской диагностики более доступных по цене и удобных в эксплуатации. Анализ данных

клинической апробации 1 3С-уреазного дыхательного теста на основе диодной лазерной спектроскопии показывает достаточно надежные результаты диагностики инфицированности Helicobacter pylori, позволяет определять степень колонизации бактерии и контролировать эффективность применяемой терапии [21 , 22]. Данные лазерной диагностики хорошо коррелируют с результатами масс-спектрометрии.

В настоящее время большая часть исследовательских работ и проведение гастроэнтерологической диагностики на основе анализа изотопного соотношения углерода в выдыхаемой двуокиси углерода осуществляются с применением масс-спектрометрических методов. Серийно производимые масс-спектрометры, специализированные на проведение уреазного дыхательного теста (BreathMAT, Finnigan MAT, Германия), достаточно дороги, что сдерживает широкое распространение изотопных методов диагностики в практической медицине. На сегодня в России имеется только два прибора BreathMAT, находящиеся в клиниках г. Москвы [www.textronica.com]. Между тем многие российские научно-исследовательские центры и организации оснащены изотопными масс-спктрометрами для измерений соотношения стабильных изотопов в газовой фазе. Использование этой техники и проведение совместных работ со специалистами в области гастроэнтерологии и гепатологии дает на сегодня реальную возможность широкого практического освоения изотопных дыхательных тестов и проведения клинико-диагностических исследований, основанных на использовании препаратов, меченых стабильными изотопами.

В данной работе продемонстрированы результаты практической реализации уреазного дыхательного теста с использованием стандартного изотопного масс-спектрометра в комплектации с двухканальной системой напуска. Представлена методика подготовки проб выдыхаемого воздуха для масс-спектрометрического измерения изотопного состава выдыхаемой



углекислоты. Приведены результаты диагностирования НР- инфекции для 11 тестируемых.

Уреазный дыхательный тест. К 1994 г. было официально признано, что инфицированность человека бактериями Helicobacter pylori (НР) является одной из основных причин возникновения гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [23, 24, 25]. Известны биохимические, эндоскопические, иммунологические, микробиологические, изотопные методы диагностики НР-инфекции. В настоящее время предпочтение отдается

неинвазивному 13С-уреазному дыхательному тесту , обладающему высокой диагностической достоверностью. Впервые тест был разработан в 1 987г. Д. Грахамом [11]. Диагностическим критерием хеликобактериоза является оценка

степени обогащения изотопом углерода С выдыхаемого СО2 при наличии уреазной активности в желудке после перорально принятой дозы мочевины,

обогащенной стабильным изотопом С углерода.

В сравнении с традиционными методами диагностики, дыхательный тест наиболее привлекателен, так как прост в исполнении, не инвазивен, безопасен для здоровья, достоверность результатов близка к 1 00%.

Схематически тест можно представить следующим образом:

п I бактерий I г3г^ та IИзотопный

- ыдох -т анализ х13СО0

Для выполнения теста достаточно взять у пациента одну контрольную пробу выдыхаемого воздуха до приема обогащенной мочевины и одну пробу выдыхаемого воздуха спустя 30 минут после приема мочевины. Если есть инфицирование Helicobacter pylori бактериями, то энзим уреаза, находящийся на поверхности бактериальной клетки, расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа. Образованный таким образом СО2, имеет обогащение

изотопом С. Продукты распада, проходя по пищевому тракту, всасываются в кровь, из крови в легкие и частично уходят в виде СО2 с выдыхаемом воздухом.

этом случае, соотношение изотопов углерода в выдыхаемом углекислом газе изменится по сравнению с пробой, отобранной непосредственно перед приемом

мочевины. Присутствие изотопа углерода С в выдохе выше принятого контрольного уровня является показателем инфицированности (положительный



результат теста). Если бактерий Helicobacter pylori в организме нет, мочевина проходит пищеварительный тракт без разложения и практически не влияет на соотношение изотопов углерода в выдыхаемом воздухе (отрицательный результат теста). Определение величины контрольного уровня для разделения

между положительным и отрицательным результатами теста чрезвычайно важно. Величина контрольного уровня определена эмпирически по результатам сравнительного анализа данных дыхательного теста с данными эндоскопии. В результате многочисленных исследований определено значение контрольного

уровня в 5% [26, 10]. Значение контрольного уровня не зависит от возраста

тестируемого и имеет универсальное применение к любым категориям пациентов.

Высокая точность и чувствительность дыхательного теста позволяет

определять степень инфицированности НР и выявлять его малые колонизации (интегральные данные по всему желудку). Осуществлять контроль эрадикации

после курса терапии, но не раньше, чем через 28 дней после прекращения

приема антихеликобактерных и антисекреторных средств.

Аналитическая процедура измерения 5 С выдоха.

Аналитическая процедура измерения изотопного состава углерода СО2

I. Сбор образца выдыхаемого воздуха в стеклянный пробоотборник.

II. Подготовка образцов к масс-спектрометрическому анализу: криогенное

разделение в вакууме СО2 выдоха от других выдыхаемых газов (азот,

кислород, вода и др.).

III. Измерение изотопного состава 8 С СО2 выдоха на масс-спектрометре. I. Пробы выдыхаемого воздуха собирают и хранят в стеклянной емкости рис. 1 . Полный выдох производят в емкость через стеклянную трубку с вентилем. После выдоха вентили 1 и 2 закрывают. Вакуумное уплотнение вентилей исключает обмен образца СО2-выдоха с атмосферной СО2. Образцы выдоха могут храниться длительное время (более 1 0 суток).

выдоха включает в следующие позиции.

Выдох




рис. 1 Емкость для сбора и хранения образца выдыхаемого воздуха.

II Подготовка образцов СО2 выдоха к масс-спектрометрическому анализу была выполнена на вакуумной установке рис.2. Установка включает следующие элементы: систему откачки до 10-5 мм.рт.ст.; датчики высокого давления; V-образную ловушку для разделения газовой смеси; вентиль с емкостью для вымораживания чистого СО2. Все элементы установки выполнены из стекла и соединены между собой с помощью вакуумных переходников. Емкость с образцом выдоха подсоединяют через переходник к вакуумной линии. Во всей системе, исключая емкость с образцом, создают давление 10-5 мм.рт.ст. После чего закрывают от системы откачки вакуумную линию и открывают емкость с образцом, распуская газ в V-образную ловушку. Вентиль между ловушкой и емкостью закрывают, замораживают ловушку жидким азотом (-1960С) и подключают к откачке. В процессе откачки азот и кислород полностью удаляются из системы, СО2 и Н2О, имеющие низкое парциальное давление при данной температуре, остаются замороженными на стенках ловушки. После откачки ловушку термостатируют -(70--80)0С при помощи охлажденного азотом спирта, СО2 полностью переходит в газовую фазу, а вода остается замороженной. Чистый СО2 собирают в емкость и подают на масс-

спектрометрическе измерение 8 С. Вся процедура подготовки занимает 5-6

Ш Измерения изотопного состава СО2 выдоха были проведены на масс-спектрометре Finnigan MAT, Бремен, Германия, модель МАТ 252. Измерения проведены относительным методом с использованием стандартной двойной системы напуска изотопов. Измерения проведены относительно рабочего стандартного газа СО2, откалиброванного по международным

Вакуум датчик

Откачка на вакуум


с образцом

Рис.2 Схема вакуумной

установки для подготовки выдыхаемого углекислого газа к масс-спектрометрическому изотопному анализу.





1 2
© 2017 РубинГудс.
Копирование запрещено.