сертифицированным стандартам NBS19, NBS18, IAEA-CO-8. Результаты

измерения 8 С СО2-выдоха представлены относительно международного стандарта VPDB.

Результаты исследований Проведена серия экспериментов по реализации уреазного дыхательного теста на оборудовании лаборатории стабильных изотопов ДВГИ ДВО РАН. В тестировании принимало участие 11 пациентов (мужчин - 7, женщин - 4, средний возраст 42±17 лет) с диагнозом хронического гастрита ассоциированного с Helicobacter pylori. Диагноз хронического гастрита поставлен на основе фиброгастродуоденоскопического исследования, морфологического изучения биоптатов слизистой и диагностики НР-инфекции с применением быстрого уреазного (CLO) теста. Обследование пациентов проведено на базе городской клинической больницы №2 г. Владивостока. Для эрадикации Helicobacter pylori была использована схема трехкомпонентной терапии, рассчитанной на 1 4 дней.

С-уреазный дыхательный тест был проведен согласно общепринятому протоколу [9, 1 0] в следующей последовательности.

Отбор пробы выдыхаемого воздуха до приема меченого препарата (базовая

проба). Прием пациентом дозы С-мочевины, растворенной в 100 мл воды или сока. Отбор пробы выдыхаемого воздуха через 30 минут после приема меченого препарата (контрольная проба).

Сбор проб поизводится в стеклянные емкости с герметичным уплотнением. Для этого тестируемый делает глубокий вдох, задерживает дыхание на 1 0 секунд, делает полный выдох через трубку в емкость и герметично ее закрывает. Отобранные пробы поступают на изотопный анализ в течение первых суток.

Для выполнения теста использована мочевина, с обогащением С (99.1 атомн. %), изготовитель ISOTEC Inc. A Matheson, USA Company, сертификат соответствия получен в лаборатории экотоксикологии Института проблем

экологии и эволюции РАН. Применяемая доза С-мочевины определена из расчета 1мг препарата на 1 кг массы тела [26, 27, 28]. Изменение изотопного

состава 8 С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями более чем на 5% принято за положительный результат теста [26, 10].

1 3 С -уреазный дыхательный тест был применен к испытуемой группе пациенов до лечения хеликобактериоза и спустя 1 месяц после терапии ( в одном случае срок между окончанием лечения и тестированием составил 1 2 месяцев).

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании пациентов до

лечения, сведены в табл. 1 . Показаны две серии результатов С-уреазного дыхательного теста. Первая серия содержит данные первичного обследования пациентов (тест1), вторая серия - данные, полученные через 10 дней при повторном обследовании этих пациентов (тест 2). Между тестами лечение не проводилось.

Таблица 1. Результаты изотопных анализов 13С-уреазного дыхательного теста

у Helicobacter pylori-инфицированных пациентов до проведения эрадикации

Тест 1 Тест 2

813Сров, %° -16.9

-9.1

-1 2.5

-1 2.9

-1 2.1 -1 0.1

-1 0.1

-0.2

-2.7

Анализ изотопного отношения углерода выдыхаемого воздуха (тест 1 )

показывает, что у всех пациентов разница между измеренным значением 813С

13 13

СО2-выдоха до и после приема С-мочевины (А С) превышает контрольный

уровень в 5%. Максимальная разность 8 С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями у пациентов в данной серии составила 25.9%, минимальная 7.8%. Полученные данные можно оценивать как положительный результат теста, что полностью согласуется с результатами гастроскопических и

морфологических исследований. Различие значений С-обогащения СО2 в выдохе между отдельными пациентами отражает разную степень бактериального инфицирования этих пациентов. Группа пациентов у которых

наблюдалось сравнительно небольшое увеличение содержания 13СО2 в контрольной пробе была протестирована повторно (тест 2). Сравнение

результатов теста 1 и 2 показало небольшие вариации изотопного отношения

углерода в выдыхаемом воздухе. Максимальное отклонение величины А С теста 1 от соответствующего значения теста 2 составляет 3.0%, минимальное

0.4%. Наблюдаемые вариации обусловлены изменением 8 С метаболического СО2 и естественными колебаниями размеров колонизации Helicobacter pylori. В целом, данные тестирований 1 и 2 показывают близкое совпадение, свидетельствуя о высокой достоверности получаемых результатов.

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании испытуемой группы пациентов после эрадикационной терапии, сведены в табл. 2. Десять пациентов были протестированы через 1 месяц по завершению терапевтического курса и 1 пациент - через 12 месяцев. В первом случае у 8-и пациентов результаты тестирования показали, что разница между измеренным

13 13

значением 8 С СО2 выдоха до и после приема С-мочевины не превышает

контрольный уровень. Максимальное отклонение контрольного значения 8 С от базового составило 1.4%. Эти данные можно оценивать как отрицательный результат теста. Для двух пациентов получен положительный результат. У

одного из них А С составила 6.8 % (табл.2, №9), что на 17% меньше соответствующего результата, полученного до лечения (табл.1, №9). У другого

пациента А С составила 16.3% (табл.2, №10), в сравнении с результатом до лечения (табл.1, №10), снижение составило 3.1%. Для пациента, прошедшего тестирование через 12 месяцев после окончания лечения (табл.2, №11), результат оказался отрицательный. Полученные данные позволяют контролировать эффективность применяемой антибактериальной терапии надежным не инвазивным методом.

I Таблица 2. Результаты изотопных анализов 13С-уреазного

Для отражения динамики изменения 8 С выдыхаемой СО2, были проанализированы образцы выдоха, которые собирали через каждые 5 минут в течение 3-х часов с момента приема 13С-мочевины. Типичная динамика

13 13

изменения 8 С выдоха после принятия С-мочевины для инфицированных и неинфицированных пациентов представлена на рис.3. У неинфицированных

пациентов отмечаются незначительные изменения 8 С выдоха во времени, в то время как для инфицированных пациентов уже в первые минуты после приема мочевины отмечено существенное утяжеление изотопного состава углерода в

о

60 80

t, мин

выдыхаемом воздухе. Увеличение 8 С продолжается в течение 25-30 минут, достигая своего максимального значения. Через 35-40 начинается плавное

13 13

снижение 8 С, продолжающееся в течение 2-3 часов. В итоге, значение 8 С

выдоха стремится к своему базовому значению. Скорость С-обогащения выдыхаемой СО2 может варьировать в зависимости от степени бактериальной

инфицированности пациента, но пик максимального 13С-обогащения

выдыхаемой СО2 регистрируется через 25-35 минут после приема пациентом

С-мочевины.

13 13

рис.3. Динамика изменения 8 С выдыхаемого СО2 после приема 70мг С-мочевины у инфицированного (квадраты) и неинфицированного (круги) пациентов. Точность результатов составляет ±0.1%.

Для определения диапазона вариаций естественного природного содержания

13 13

изотопа С в СО2 выдоха проведена серия измерений 8 С СО2 в выдыхаемом воздухе у 1 6 испытуемых в возрасте 35±25 лет. В целом, полученные значения

8 С варьируют в пределах от -22. 1 % до -24.7%. Наблюдаемые природные вариации незначительны, что обусловлено однотипным составом пищи в

рационе тестируемых. Среднее значение 813С СО2 в выдохе данной группы лиц составляет -23.2%. Однако принимать в дыхательном тесте среднюю величину как универсальное значение естественного содержания 13С изотопа в выдохе у пациентов недопустимо. Полученное в данной серии измерений отклонение

813С различных образцов выдоха от их среднего значения составило более 1 %. Такое отклонение может явиться критичным при постановке диагноза. Очевидно, что при тестировании следует определять естественное природное

1 3С -обогащение выдыхаемого углекислого газа для каждого пациента индивидуально.

Заключение. На базе аналитического оборудования лаборатории стабильных изотопов ДВГИ ДВО РАН проведена апробация уреазного дыхательного теста. Применяемый комплекс аппаратуры для пробоподготовки и масс-спектрометрического измерения изотопного состава позволяет выполнять изотопные анализы углерода СО2 выдыхаемого воздуха с высокой точностью и производительностью. Продемонстрированы результаты практической реализации уреазного дыхательного теста с использованием меченой изотопом

1 3С мочевины. Аналогичное масс-спектрометрическая оборудование, имеющееся в распоряжении многих российских научно-исследовательских центров и организаций, может быть предложено на сегодняшний день, как альтернатива специализированным, но малодоступным по ряду причин приборам для проведения дыхательных тестов. Сотрудничество специалистов в области изотопной масс-спектрометрии с гастроэнтерологами и гепатологами дает на сегодня реальную возможность широкого практического освоения в Россиии изотопных дыхательных тестов и проведения клинико-диагностических исследований, основанных на использовании препаратов, меченых стабильными изотопами. Литература.

1. Bier DM. The use of stable isotopes in metabolic investigation. Baillieres Clin Endocrinol Metab 1987, 1(4) 817-836

2. Thomson GN, Pacy PJ, FordGC, Halliday D. Practical considerations in the use of stable isotope labelled compaunds as tracers in clinical studies. Biomed Environ Mass Spectrom 1989, 18(5) 321-327

3. Koletzko B, Sauerwald T, Demmelmair H. Safety of stable isotope use. Eur J Pediatr 1997, 156 (Suppl. 1) 12-17

4. Trowbridge FL, Graham GG, Wong WW. Body water measurements in

premature and older infants using H2 O isotopic determinations. Pediatr Res 1984, 18, 524-527

5. Jones PJ, Leatherdale ST. Stable isotope in clinical reseach: Safety reaffirmed(editorial). Clin Sci 1991, 80(4), 277-280

6. Weaver LT, Amarri S, Swart G. C mixed triglyceride breath test. Gut 1998,

43(suppl 3), 1 3-1 9

7. Becker M. C breath tests for measurement of liver function. Gut 1998, 43(suppl

3), 25-27

8. Heinonen OJ, Takala J. Moderate carnitine deplition and long-chain fatty acid oxidation, exeercise capaciti, and nitrogen balance in the rat. Pediatr Res 1 994, 36,

282-292

9. Logan RPH, Dill S, Bauer FE, Walker MM, Hirschl AM, Gummett PA, Good D,

Mossi S. The European C-urea breath test for the detection of Helicobacter pylori. Eur J Gastroenterol Hepatol 1991, 3, 915-921.

10. Graham DY, Klein PD. What you should know about the methods, problems, interpretations, and use of urea breath tests. Am J Gastroenterol 1991, 86, 1118-1122

11. Graham DY, Klein PD, Evans-DJ Jr, Evans-DG, Alpert LC, Opekun AR,

Boutton TW. Campylobacter pylori detected noninvasively by the C-urea breath test. Lancet 1987, i: 1174-1177

12. Urey H.C. The thermodynamik properties of isotopic substances. J.Chem.Soc. 1947, 562-581

13. Bigeleisen J., Mayer M.J. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J.Chem. Phys. 1948, 15, 261-267

14. Bigeleisen J. The effects of isotopic substitutions on the rates of chemical reactions. J. Phys.Chem. 1952, 56, 823-824

13 12

15. Smith B.N., Epstein S. Two categories of C/ C ratios for higher plants. Plant

Physiol. 1 971 , 47, 380-384

16. Nakamura K, Schoeller D.A., Winkler F.J., Schmidt H.L. Geographical variations in the carbon isotope composition of the diet and hair in contemporary man. Biomed. Mass. Spectrom. 1982, 9(9), 390-394

17. Craig H. Isotopic standards for carbon and oxygen and correction factors for mass-spectrometric analysis of carbon dioxide. Geochim Cosmochim Acta 1957, 12,

1 33- 1 49

18. Stellaard F., Geypens B. European interlaboratory comparison of breath CO2

analysis. Gut, 1 998, (suppl 3), 2-6

19. Savarino V., Mela G.S., Zentilin P., Bisso G., Pivari M., Mansi C., Mele M.R., Biliardi C., Vigneri S., Celle G. Comparison of isotope rati mass spectrometry and nondispersive isotope-selective infrared spectroscopy for C-1 3-urea breath test. Am. J. Gastroenterology

20. Степанов Е.В. Лазерный анализ изотопического отношения углерода

13 12

13C/12C в СО2 выдыхаемого воздуха. Квантовая электроника. 2002, 32, 981-986

21. Ивашкин В.Т., Никитина Е.И., Понуровский Я.Я., Селиванов Ю.Г., Степанов Е.В. C-13 уреазный дыхательный тест на основе лазерной спектроскопии: клиническая апробация. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1999, T.IX, № 2, стр.53-60

22. Ивашкин В.Т, Никитина Е.И., Степанов Е.В., Миляев В. А., Зырянов П.В.

Основы лазерного С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения. В сборнике Helicobacterl Pylori: Революция в гастроэнтерологии , Москва, 1999, стр. 130-159

23. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH Consensus Development panel on Helicobacter pylori in pepttic ulcer disease. JAMA

1 994, 272, 65-69

24. Tytgat GNJ, Rauws EAJ. Campylobacter pylori and its role in peptic ulcer disease. Gastroenterol Clin North Am. 1990, 19, 183-196.

25. McGowan CC, Cover TL, Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastric acid: biological and therapeutic implication. Gastroenterology 1 996, 11 0, 926-938

26. Logan RPH, Poison RJ, Misiewicz JJ, Rao G, Karim NQ, Newell D, Johnson P,

Wadsworth J, Walker MM, Baron JH. Simplified single sample 13Carbon urea breath

test for Helicobacter pylori: comparison with histology, culture and ELISa serology. Gut 1991, 32,1461-1464

27. Eggers RH, Kulp A, Tegeler R, Ludtke FE, Lepsien G, Meyer B, Bauer FE A

methodological analysis of the C-urea breath test for the detection of Helicobacter

pylori infection: high sensitivity and specificity within 30 min using 75 mg of 13C-urea. Eur J Gastroenterol Hepatol 1 990, 2, 437-444

28. Atherton JC, Spiller RC. The urea breath test for Helicobacter pylori. Gut 1 994,

35, 723-725