Популярное

Мифы о звукоизоляции



Как построить дом из пеноблоков



Как построить лестницы на садовом участке



Подбираем краску для ремонта



Каркасные дома из дерева


Главная » Исследование спектров флюоресценции

Исследование спектров флюоресценции ALA-индуцированного ppix периферических опухолей

in vivo

Патока Е.Ю (Patokamed@yandex.ru Харнас С.С.(1)., Заводнов В.Я.(1)., Аблицов Ю.А.(1)., Рыбин В.К.(1), Коган Е.А.(1), Завражина И.Н.(1), Каримова Л.Н(2)., Березин А.Н.(3), Лощенов В.Б(2).

(1) Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова НИИ Грудной Хирургии,

(2) ЦЕНИ ИОФ РАН (3) МИРЭА

Заболеваемость и смертность от онкологических заболеваний является одной из главных проблем здравоохранения во всем мире и нашей стране. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований в мире возрастет в 2 раза за период с 1999 года по 2020 год: с 10 до 20 млн новых случаев и с 6 до 12 млн регистрируемых смертей. Самую высокую ступень в перечне форм онкологических заболеваний занимал и занимает рак легкого -1 .3 млн. в год. (1 )

Основной причиной распространенности опухолей легких является позднее обращение за медицинской помощью, сложность обнаружения ранних форм. Появление фиброволоконной оптики позволило расширить возможности дифференциальной диагностики легочных заболеваний. Однако, визуальный осмотр бронхиального дерева при фибробронхоскопии не всегда позволяет обнаружить ранние формы рака легкого и однозначно трактовать полученные макроскопические данные. В связи с этим перспективным является поиск новых методов исследования, позволяющий выявлять ранние злокачественные изменения легких. Одним из таких методов является флюоресцентный метод, основанный на возможности распознавании злокачественных новообразований по индуцированной световым излучением характерной флюоресценции экзогенных или эндогенных порфиринов. Метод лазерной аутофлюоресцентной спектроскопии основан на регистрации флюоресценции эндогенных порфиринов, концентрация которых в опухоли в 2-4 раза выше, чем в нормальной ткани (2,5) и широко используется для дифференциальной диагностики новообразований



различных локализаций : желудочно-кишечного тракта (3,4,11), мочевого пузыря (5), легких (6,7,13).

Метод аутофлюоресцентной лазерной спектроскопии является высокоэффективным (5) , однако в связи с невысоким содержанием эндогенных порфиринов в тканях для определения их реальной концентрации необходимы высокочувствительные анализаторы. Другой метод основан на анализе спектров флюоресценции с предварительным введением экзогенного фотосенсибилизатора, который избирательно накапливается в злокачественной ткани. В нашей стране в качестве фотосенсибилизаторов используются препараты, относящиеся к группе производных гематопорфирина ( Фотофрин I и II (США), Фотосан (Германия), Фотогем (Россия). Однако эти препараты имеют ряд недостатков: низкое поглощение в красной области спектра, низкую интенсивность и контрастность флюоресценции, замедленное выведение из организма, обуславливающее высокую фототоксичность. Альтернативным путем создания эффективных концентраций фотосенсибилизатора в опухоли является стимуляция к продукции эндогенных порфиринов посредством экзогенного введения их предшественников. Таким предшественником является 5-аминолевулиновая кислота. При использовании 5-АЛА в качестве фотосенсибилизатора накопление протопорфирина IX в опухоли происходит быстро с высокой контрастностью флюоресценции по отношению к нормальным тканям, что характеризует высокую диагностическую эффективность метода. (1 0,1 6,1 8,1 7,1 9)

Для изучения диагностических возможностей метода лазерной флюоресцентной спектроскопии у пациентов с хирургическими заболеваниями легких на базе НИИГХ и факультетской хирургической клиники им. Н.Н. Бурденко Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова за период с 1993 по 2003гг. было обследовано 98 пациентов с различными заболеваниями легких, включающими злокачественные опухоли.

Наиболее сложным для эндоскопической диагностики и верификации диагноза является периферический рак легкого. Из всей группы больных пациентов с периферическим раком было 35 человек. Исследования проводились с использованием портативного многоканального лазерного спектрального анализатора последнего поколения ЛЭСА 01 совместного производства объединения Биоспек (Россия) и ЦЕНИ ИОФ РАН, с программным обеспечением для работы в операционной среде Microsoft Windows98-2000.

Относительно простая компактная система позволяет получать спектр диффузного отражения и флюоресценции с



интервалом 0,1 сек., что достаточно для мониторинга в реальном масштабе времени. Схема прибора позволяет производить регистрацию спектра флюоресценции в ускоренном режиме в диапазоне длин волн от 400 до 850 нм одновременно по более чем 3000 каналам. Система оснащена гибким V-образный многоканальным волоконно-оптическим катетером диаметром 1,8 мм, малый диаметр и гибкость позволяют вводить катетер в биопсийный канал эндоскопа для исследования полых органов, в том числе трахеи и бронхов, обеспечивая непосредственный контакт с исследуемой поверхностью (9,1 0,11 ).

Схема портативной спектроскопической системы

представлена на рис. 1.

Входной конец


лазер

Принцип работы системы следующий:

Свет от лазерного источника фокусируется на входной конец V-образного волоконно-оптического катетера. В работе мы использовали гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм и мощностью 25 мВт. Такая длина волны позволяет достичь наиболее возможной глубины проникновения до 3 мм. Дистальный конец диагностического катетера (общий диаметр 1 ,8 мм) устроен таким образом, что его можно вставить в биопсийный канал обычного



эндоскопа для исследования полых органов. Флюоресцентный и рассеянный свет поступает в приемные волокна (6 штук), которые окружают волокно для доставки света, последнее соединено со спектрографом. Волокна на выходном конце сформированы в ряд с тем, чтобы увеличить разрешение системы. Спектрограф вместе с электроникой для сбора данных смонтирован на плате компьютера, которая вставляется в ISA-слот станции расширения компьютера Notebook. Приемный сигнал оцифровывается, передается в память компьютера и изображается на дисплее в реальном масштабе времени. Многофункциональность применения данной системы обеспечивается также специальным программным обеспечением, работающим в среде Windows. Для того чтобы система могла эффективно использоваться в биомедицинских и клинических приложениях имеется возможность проводить анализ спектральной информации в реальном масштабе времени.

При проведении эндоскопической Аласенс-индуцированной ФД использовалась эндоскопическая видеосисиема, включающая в себя фибробронхоскоп фирмы Olympus BF-40, TV-OTV-F2 -видеокамеру, TV-монитор, контроллер CCU, видеомагнитофон для ведения фото- и видеоархива больных. Полученные фото и-видеоматериалы заносились в память ПК с помощью цифровой видеокарты .

У пациентов с периферическими новообразованиями легкого, если опухоль не определялась визуально (не прорастала в центральные бронхи), эндоскопическая ФД выполнялась путем катетеризации измерительным волокном спектроанализатора всех субсегментарных бронхов, наиболее приближенных к опухоли. В случае, если опухоль имела малые размеры (менее 5 см), исследование выполнялось под рентгенологическим контролем.

Перед каждой серией измерений проводилась калибровка системы по длинам волн и интенсивности сигнала, проводимая с использованием стандартных образцов, изготовленных на основе редкоземельных элементов и по своим оптическим свойствам близким к характеристикам исследуемых тканей. Процедура регистрации сигнала занимала 1 -2 секунды. Измерения на каждом больном проводили не менее чем в 3-х точках, для вычисления ошибки погрешности измерения.

Исследования проводили в 2-х режимах. 1 . Режим измерения в действительном времени, позволяющий проводить непосредственное наблюдение за спектральным сигналом на экране дисплея, при сканировании поверхности



исследуемого участка ткани, путем плавного перемещения измерительной части катетера вдоль исследуемой поверхности. Это позволяло выделять участки с отличными характеристиками флюоресценции и рассеянной лазерной компоненты. Полученные данные обсчитывались при помощи специальной компьютерной программы.

2. Второй режим - спектрально- флюоресцентная характеристика исследуемой ткани. После измерения спектров флуоресценции исследуемых тканей, для каждого спектра оценивались следующие характеристики:

а) интенсивность в относительных единицах ( отн.ед.), выраженная в процентах по длине волны 633 нм.- интенсивность рассеянной лазерной компоненты (J);

б) максимальная интенсивность флуоресценции в диапазоне 660-680 нм- интенсивность флуоресценции фл).

Каждый спектр характеризовался параметром К , где i=1 n,

равному отношению интенсивности флуоресценции к интенсивности рассеянной лазерной компоненты.

По измеренному соотношению интенсивности рассеянной лазерной компоненты и максимальной величины интенсивности флюоресценции оценивали коэффициент диагностической контрастности (КДК), показывающую во сколько раз интенсивность флуоресценции одного исследуемого участка (К1), например опухоли, выше интенсивности другого участка (К2), например нормальной слизистой бронха.

Это может быть выражено следующей формулой:

ДК=фл.оАл.о.) / Афл.нАл.н.) или К1/К2 где флю^ -фл.н.-

интенсивности флуоресценции опухоли и нормальной ткани

а -л.о. , Jл.н.-

интенсивности рассеянной лазерной компоненты опухолевой ткани и нормальной ткани соответственно.

Для создания архивизированной системы данных, полученных при ФД у всех пациентов из изучаемой группы, была составлена специальная форма протокола флюоресцентно-диагностического исследования, куда вносились индивидуальные данные пациента, направительный диагноз и комментарии по полученной спектроскопической картине. Для вычисления относительной интенсивности флюоресценции мы использовали отношение площади под пиком флюоресценции (650-900 нм) к площади лазерного излучения (628-638 нм). Эта процедура необходима для того, чтобы учесть эффекты геометрии измерений, мощности лазерного излучения, которая может варьировать от измерения к



измерению, а также избежать влияния имеющихся в просвете бронхов поглощающих свет веществ, таких как кровь, бронхиальный секрет. Таким образом, мы могли сравнивать спектры, полученные от разных пациентов, несмотря на то, что измерения проводились при разной мощности лазера или при наличии биологических примесей, которые поглощают как флюоресцирующий свет, так и лазерное излучение.

В связи с индивидуальными оптическими свойствами большинства периферических новообразований легкого, обработка данных ФД у пациентов с периферическими новообразованиями легких, не прорастающих в центральные бронхи, отличалась по своей сути от таковой у пациентов с центральным раком легкого и периферическими новообразованиями легких с централизацией. При расчете коэффициента диагностической контрастности (КДК) лазерная и флюоресцентная компоненты спектра рассматривались отдельно. Сначала отдельно рассчитывались площади под пиком отраженного лазерного света от ткани бронха, наиболее приближенного к опухоли и здорового бронха противоположного легкого (Тл.о. / Тлн ). Затем аналогично рассчитывались площади под пиками флюоресценции (тфл.о/тфл.н.). После полученный коэффициент флюоресценции предполагаемой опухоли (Тфл.о./Тфл.н.) умножают на коэффициент рассеянного лазерного света. Для примера рассмотрим протокол спектроскопического исследования пациента Н. с периферическим новообразованием нижней доли правого легкого. В спектральном окне (рис. 1 ) представлены спектры, зарегистрированные с бронха, наиболее приближенного к опухоли (В9), его субсегментарных ветвей В9(а), В9(в); В9(с) и спектры, полученные с аналогичных бронхов противоположного легкого, а так же спектры губы и кожи руки пациента. По оси Х отложена длина волны в нм. По оси Y отложена интенсивность флюоресценции и рассеянного лазерного света в относительных единицах. На гистограмме №1 отражено отношение интенсивности лазерной линии к интенсивности флюоресценции АЛК-индуцированного протопорфирина IX в зоне опухоли и здоровых бронхах.

На гистограмме №2 можно видеть распределение интенсивности лазерной линии, а на гистограмме №3 -распределение интенсивности флюоресценции с указанных участков бронхиального дерева. Из диаграммы № 2 видно, что величины отраженного лазерного света в проекции опухоли имеют высокие значения от 7,2 относительных единиц до 10, Тл.о=8,6, по сравнению с таковыми, зарегистрированными со здоровых бронхов (от 3,5 до 4,3, Тл.н=3,53). При рассмотрении величины флюоресценции на



гистограмме №3 так же видно, интенсивность АЛК-индуцированного протопорфирина IX в проекции опухоли = 41,7 выше, чем в здоровых бронхах Jфл.н = 24,6.

С^л.о. / >Тл.н ) 2,4 Афл.оАфл.нз 1,7

КДК=Афл.о.Ял.о.) * Афл.н.Атн.) или К1*К2.

То есть, КДК в данном случае равен 4,1

2 0001 8001 6001 4001 200 1 000 800 600 400 200


[0] Рука пациента

[1] Рука пациента

- [2] Губа пациента

[3] Губа пациента

[4] Рука в рача

[5] Опухоль [6] Опухоль [7] Опухоль [8] Опухоль

- [9] Опухоль [1 0] Опухоль

- [11] нормальный бронх

[12] нормальный бронх

[13] нормальный бронх [1 4] нормальный бронх [1 5] нормальный бронх

J16] нормный бронх

Рис. !. Спектры АЛК- индуцированной флюоресценции в бронхах пациента Н. после приема препарата Аласенс 1,5 перорально

3 ,..........

2 ...........

г

0 Ln

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Гистограмма №1. Отношение интенсивности лазерной линии к интенсивности флюоресценции АЛК-индуцированного протопорфирина IX линии в бронхах пациента Н. после препарата Аласенс 1,5 перорально

9 000 8 000

7 000 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000

1 000


10 12

Гистограмма №2. Величина интенсивности лазерной линии в бронхах пациента Н. после приема препарата Аласенс 1,5 перорально




Гистограмма №3. Величина интенсивности флюоресценциив АЛК-индуцированного Протопорфирина IX в бронхах пациента Набатова после приема препарата Аласенс 1,5 перорально

При анализе полученных при бронхоскопии и интрапоперационно данных в тканях опухоли регистрировались спектры флюоресценции, характерные для опухолевой ткани с большой оптической плотностью, что по- видимому, связано характерной ригидностью тканей периферических опухолей легких.

С помощью метода лазерной АЛК-индуцированной спектроскопии диагноз рак легкого был выявлен у 31 больного из всей группы и подтвержден морфологически на микро - и макропрепаратах. У двоих пациентов диагноз был отвергнут.

Таким образом, разработан эффективный и безопасный способ, позволяющего врачу эндоскописту во время рутинного исследования прицельно выполнять биопсию, устанавливать или подтверждать диагноз.

ЛИТЕРАТУРА:

1.Peto The causes of cancer ,European Jounal of Cancer, Vol. 35, Suppl. 4, Sept., 1999, page 125, abs.446., 10-я Европейская онкологическая конференция ,12-16 сентября, Вена 2.Кузин М.И. и соавт., 1995г., Харнас С.С., 1997 г., Sharabasy MM, Waseef AM, Hafez MM, Salim SA, Porphyrin metabolism in some malignant diseases , Cancer. 1992 Mar. 65(3),409-12.

3.Кузин М.И., Кузин Н.М, Шкроб О.С. и др., Хирургия, 1995, №5, с.

35-37

4.Hung J, Lam S. Et al, Lasers Surg Med 1991-v11,N2,P.99-105, 5.Koenig F, McGovern et all., Urol.,1996,Nov,156(5),p. 1597-1601



6.Рыбин В.К., Дифференциальная диагностика хирургических заболеваний легкого с помощью аутофлуоресцентной спектроскопии , 1 993 г.

7. Vermylen P, Pierard P, Routosse C.,Lung Cancer 1999 Sept 25:3 161-166.Detection of bronchial preneoplastic lesionsand early lung cancer with fluorescence bronchoscopy a stady about its ambulatory feasibility ander local anaesthesis.

8. Freitag L, Korrupp A, Itzigehl I., Pneumology 1996, Oct 50:10 693-9. Experiences with fluorescence diagnosis and photodynamic therapy in a multimodality therapy concept of operated ,recurrent bronchial carcinoma.

9. Харнас С.С., Дадвани С.А., Заводнов В.Я., Охотникова Н.Л., и др. Использование фотосенсибилизатора Аласенс в дифференциальной диагностике заболеваний желудка ,материалы III Всероссийского симпозиума по фотодинамической терапии, 1999г.,стр. 96-101

1 0.В.Б. Лощенов, А.А. Стратонников, А.И. Волкова, А.М. Прохоров Портативная спектроскопическая система для флюоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией , Российский химический журнал, №5, 1 998, том XLII. стр. 50.

11.Loschenov, Victor В.; Baryshev, M. V.; Kuzin, M. I.; Zavodnov, V. Y.; Uspensky, L. V.; Ablitsov, U. A.; Loginov, L. E.; Rybin, V. K. Spectral-autofluorescent diagnostics of stomach and lung cancer , SPIE Proc., V. 1420, 271-281, (1991).

12. Успенский Л. В., Дадвани С. А., Чистов Л. В., Коган Е.А., Лощенов В.Б., Аблицов Ю.А., Рыбин В.К., Заводнов В.Я., Шикторов Д.И., Сербиненко Н.Ф., Семенова И.Г. Эндобронхиальная лазерная терапия в комплексной предоперационной подготовке больных хирургическими заболеваниями легких , Хирургия, № 10, (1999).

1 3.Дадвани С.А., Харнас С.С., Чилингариди К.Е., Лощенов В.Б., Ветшев С.П. Лазерная аутофлуоресцентная спектроскопия - новый метод экспресс-диагностики в хирургии . (Обзор). Хирургия , №

10. 1999 года. стр. 75 - 79

1 4.Ветшев П.С., Чилингариди К.Е., Ипполитов Л.И., Харнас С.С., Лощенов В.Б., Габаидзе Д.И., Дуплик А.Ю. Первый опыт применения лазерной спектроскопии в хирургическом лечении заболеваний щитовидной железы . Проблемы эндокринологии ,

№ 1, , стр. 17 - 20, (1999).



15.Douplik, A.Y., A.A.Stratonnikov, V.B. Loschenov., V.S. Lebedeva, V.M. Derkacheva, A. Vitkin, V.D. Rumyanceva, S.G. Kuzmin, A.F. Mironov, E.A. LukYanets (2000) The study of photodynamic reactions in human blood . J. Biomed. Optics, 5, p.338-349 (2000).

16.Патока Е.Ю., Харнас С.С.. Заводнов В.Я., Лощенов В.Б.. Лукьянец Е. А. Применение фотосесибилизатора Аласенс для флюоресцентной диагностики заболеваний легких. Первый опыт. Международная конференция Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века . Научно- практическая конференция Севере- Западного региона Российской федерации. II часть. Санкт-Петербург, 2001 год. Стр 431

17.Патока Е.Ю., Харнас С.С.. Заводнов В.Я., Лощенов В.Б.. Лукьянец Е.А. Эндоскопическая флюоресцентная диагностика периферического рака легкого при пероральном применении фотосенсибилизатора Аласенс . Материалы III съезда фотобиологов России., Воронеж, 2001 год.

18. Патока Е.Ю.. Харнас С.С., Рыбин В.К., Лощенов В.Б., Каримова Л.Н Флюоресцентная диагностика рака легкого при пероральном пути введения препарата Аласенс . Тезисы научно-практической конференции Отечественные противоопухолевые препараты , 17-20 марта 2002 года,стр.136.

19. Патока Е.Ю., Харнас С.С., Лощенов В.Б.Заводнов В.Я., Каримова Л.Н. Дифференциальная диагностика рака легкого с помощью флюоресцентной спектроскопии АЛК-индуцированного протопорфирина IX при ингаляционном и пероральном введении препарата Аласенс^Ь-й международный конгресс по эндоскопической хирургии, Москва,24-26 апр 2002.



© 2017 РубинГудс.
Копирование запрещено.