Популярное

Мифы о звукоизоляции



Как построить дом из пеноблоков



Как построить лестницы на садовом участке



Подбираем краску для ремонта



Каркасные дома из дерева


Главная » Использование малых моделей

Использование малых моделей искусственных экосистем для изучения взаимодействия ризобактерий с растением-хозяином и микроскопическими почвенными грибами

Минаева О.М. (mom05@mail.ru), Акимова Е.Е.

НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета

Ухудшение экологической ситуации в сельском хозяйстве, в частности увеличение пестицидной нагрузки на поля, способствовало развитию в агробиотехнологии направления по созданию биопрепаратов на основе PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria) (Benizri et al., 2001). За миллионы лет эти бактерии выработали механизмы симбиоза с растением, которые включают регулировку роста и развития растения за счет выделения фитогормонов, витаминов, обогащения зоны ризосферы азотом, усилением поглощения растением питательных элементов (Benizri et al., 2001; Dijkstra et al., 1987; Geoffrey et al, 2001; Krasilnikov, 1958; Nelson, 2004; Palleroni, 1981; Воронин, 1998; Ермолова, 1992; Сидоренко, 2001) и защиту их от патогенов, благодаря синтезу PGPR абиотических, в частности антифунгальных, веществ и т.д. (Berg et al, 2001; Meena et al, 2002; Neilsen et al, 2000; Воронин, 1998).

Современная концепция развития биологического метода защиты растений в целом предусматривает не простое уничтожение вредных организмов, а управление популяциями вредных и полезных видов в агроэкосистемах (Соколов, 1990). Для чего становится необходимым изучение механизмов взаимодействия ризобактерий с высшими растениями и микроскопическими почвенными грибами.

При изучении взаимодействия микроорганизмов и растений недопустимо проводить над биосферой эксперименты любого типа. Это можно сделать с малыми моделями экосистем, то есть с искусственными экосистемами различной степени сложности. Малые искусственные экосистемы, являясь упрощенными моделями природных, - новый эффективный инструмент для установления ведущих взаимосвязей и факторов, определяющих их развитие. Эта модель дает возможность изучить количественные законы развития и поведение популяций и их сообществ, а также использовать их в охране окружающей среды. Наиболее мобильными элементами в любой экосистеме являются микроорганизмы, их особая роль в искусственных экосистемах объясняется тем, что микроорганизмы, имея мощный ферментативный аппарат, разнообразные механизмы адаптации, высокие скорости размножения, замыкают трофические цепи. Микробные популяции в искусственных экосистемах - объект фундаментальных исследований, поэтому изучение их возможностей, места и функций, дает перспективу через микробное звено контролировать, прогнозировать, и, возможно, в какой-то мере, управлять программой развития экосистем в целом (Сомова Л. А., 1999).

Использование моделей искусственных экосистем позволяет изучить механизмы взаимодействия ризобактерий с растением-хозяином, почвенными микроскопическими грибами и другими ризосферными организмами, что увеличит эффективность применяемых биопрепаратов. Кроме того, такие модели дают возможность проследить концентрационные зависимости наблюдаемых эффектов. Следует отметить, что вопросы кинетики стимулирования развития растений и кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов в настоящее время практически не изучены.

Одной из наиболее показательных малых моделей является модель наземной экосистемы, состоящая из трех звеньев, включающая в себя искусственный субстрат ( почву ), которым заполняются вегетационные сосуды, растение и ризосферные микроорганизмы, предложенная Сомовой Л. А. (1999). Благодаря использованию данной модели становится возможным в стерильных лабораторных условиях in planta проследить зависимости



параметров роста растений, биомассы, количества и длины корней от концентрации бактериальных клеток в инокуляте.

Как известно из литературных источников, рост любого органа, как и самого растения в целом, описывается S-образной (сигмоидальной) кривой Сакса, которая отражает неравномерность данного процесса в онтогенезе при постоянных внешних условиях и носит общебиологический характер. Среди множества количественных моделей роста растений наибольшее распространение получила логистическая функция (Генгель, 1965). Логистическая кривая носит симметричный характер, т.е. скорость роста на начальном этапе увеличивается так же быстро, как и падает на заключительном этапе развития растения или органа. Однако не всегда характер роста может быть описан этой кривой. Если рост на начальном этапе замедлен, то кривая приобретает экспоненциальный вид; если же кривая ассиметрична в результате замедленного роста на заключительном этапе, то можно воспользоваться функцией Б. Гомпертца.

И.П. Савиновым была предложена обобщенная формула роста (Смиряев., Мартынов, Кильчевский, электрон. изд).

- к )

где к - конкретное вещественное число (-со<к<+оо); е - основание натурального логарифма; b<0.

Меняя значения коэффициента к, можно получить любой тип кривой. При к=-1 функция принимает логистический вид, а при к=1 - экспоненциальный. Следует подчеркнуть, что тип кривой роста, определяемый коэффициентом к, изгиб и наклон кривой, зависящие от констант a и b, находятся под генетическим (отражающим реализацию генетической программы развития растений в онтогенезе) и средовым контролем (Смиряев., Мартынов, Кильчевский, электрон. изд).

Для примера на рисунке 1 отображено изменение длины проростка пшеницы с течением времени в варианте с инокуляцией Pseudomonas sp. В-6798 в концентрации 106 кл./мл.

160 -.-.-.-.-.-.-.-.-1

о о ер о

0 С-,-,-,-,-,-,-,-,-1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

время, ч

Рисунок 1- Изменение длины проростка пшеницы с течением времени при инокуляции Pseudomonas sp. В-6798 в концентрации 106 кл./мл

Как видно из рисунка, рост пшеницы на изучаемом этапе соответствует S-образной кривой. Для описания данной кривой нами было использовано логистическое уравнение следующего вида (Ризниченко, Рубин, 1993):



Aert

B + x0ert

где y соответствует длине проростка с течением времени (мм); t - время (ч); r - скорость удлинения проростка (мм/ч); x0 - минимальная длина проростка, соответствующая длине проростка после активации зерна в течение 24 часов (мм); А - константа уравнения, численно соответствующая произведению минимальной длины проростка на максимально возможную в условиях эксперимента (мм) (A=x0xmax); В - константа уравнения, численно соответствующая вычитанию минимальной длины проростка из максимальной (мм) (В=

xmax-х0).

Анализ кинетических параметров показал, что при использовании логистической формулы для описания роста растений, влияние бактериальной концентрации отчетливо прослеживается на теоретическую, максимально возможную в условиях эксперимента, длину проростка (xmax); при использовании экспоненциальной формулы роста параметром, находящимся под концентрационным влиянием, является х0. Распределение этих параметров в зависимости от логарифма бактериальной концентрации, как правило, имеет вид колоколообразной кривой с перегибом. Подобный вид также принимают концентрационные зависимости параметров развития растений (количество корней, суммарная длина корневой системы, биомасса и т. д.). Экстремум выпуклой линии соответствует оптимальным концентрациям, в которых значение величины изучаемого параметра максимально.

Для примера на рисунке 2 приведено изменение минимальной длины проростка кукурузы (x0) в зависимости от концентрации названного штамма псевдомонад в инокуляте.


102 1 03 1 04 1 05 1 06 1 07 1 08 1 09

концентрация бактерий в инокуляте, кл./мл

Рисунок 2 - Влияние концентрации Pseudomonas sp. B-6798 в инокуляте на длину проростка кукурузы после активации зерна в течение 24 часов (x0)

Как видно из приведенного рисунка наибольшее влияние на x0 оказала концентрация бактерий 106 кл./мл, где увеличение данного параметра является максимальным и в 5,5 раз превышает контрольные значения минимальной длины.

Рост и развитие растений проходят в конкретных условиях среды. Взаимодействие генотипа и среды определяется, с одной стороны, способностью организма реализовать определенное значение признака в различных, как оптимальных, так и стрессовых условиях (нормой реакции генотипа), а с другой - силой действия на организм фактора среды или их совокупности. Количественно реакция генотипа по величине признака на один фактор среды



выражается кривой оптимума (Смиряев., Мартынов, Кильчевский, электрон. изд). Кривые толерантности или кривые оптимума, согласно закону толерантности, сформулированной В. Шелфордом (Смиряев., Мартынов, Кильчевский, электрон. изд), зависят от условий среды и оказывают влияние на скорость протекания биологических процессов. Кривая оптимума имеет колоколообразный вид. В зоне оптимума значение признака максимально, в зонах максимума или минимума значение признака минимально. Закон толерантности справедлив не только для отдельных особей, но также на популяционном и видовом уровне.

Количественно кривую оптимума можно выразить формулой (Смиряев., Мартынов, Кильчевский, электрон. изд):

a0 + a1 x + a 2 x

степень изменения фактора среды, а0, а1, а2

коэффициенты

где У - значение признака; уравнения.

В целом, полученная нами кривая соответствует описанному закону толерантности и может быть описана представленной кривой оптимума. Исходя из полученных данных, в зону оптимума, как правило, попадают концентрации бактериальных клеток 105-107 в мл. При анализе удельной скорости роста (r) четкой кривой оптимума выявлено не было, хотя в ряде вариантов наблюдается тенденция к выделению пика в концентрации, обычно соответствующей зоне оптимума для этого бактериального штамма.

Эффективность бактериальных штаммов можно оценить, сравнивая концентрации приходящие на зону оптимума, и наибольшие значения изучаемого параметра (например, биомассы растений).

Использование модели взаимодействия бактерий с грибами in vitro, основанной на измерении скорости роста колоний гриба на плотных питательных средах, с различной концентрацией бактерий в чашках Петри, позволило описать кинетику ингибирования роста фитопатогенных грибов (Минаева, Акимова, 2005).

На рисунке 3 показаны увеличения диаметров колоний гриба с течением времени при отсутствии бактерий и при их наличии в различных концентрациях на примере роста колоний гриба Fusarium oxysporum var. lini при различных концентрациях клеток Pseudomonas sp. штамм В-6798.

50 \

о о

ю к

&


время, ч

Рисунок 3 - Рост колоний гриба Fusarium oxysporum var. lini при различных концентрациях клеток Pseudomonas sp. штамм В-6798

Примечание. 1 - рост колоний в контроле; 2 - при концентрации бактерий в инокулюме 103 кл./мл; 3 -

при концентрации бактерий в инокулюме 106 кл./мл; 4 - при концентрации бактерий в инокулюме 109 кл./мл.



Из литературных источников известно, что рост филоментозных организмов, т.е. увеличение их биомассы, не подчиняется экспоненциальному закону. Зависимость роста гифов гриба от времени линейна, что предполагает линейный во времени рост диаметра колоний (Миллер, 1976; Перт, 1978; Бейли, Оллис, 1989). В наших экспериментах, как видно из рисунка 3, рост колоний гриба также является линейным, причем, с увеличением бактериальной концентрации, как правило, происходит замедление роста гриба, которое отражается в уменьшении наклона прямых, но никогда не приводит к полному подавлению роста вообще. В качестве количественной оценки скорости роста гриба использовался тангенс угла наклона прямых, отражающих изменение диаметра колоний грибов с течением времени к оси абсцисс.

Для описания кинетики ингибирования роста изучаемых видов грибов исследуемыми бактериями, нами было использовано модифицированное уравнение Н.Д. Иерусалимского (Евдокимов Е.В., 2001). Предложенное уравнение имеет следующий вид:

V (C) = Vm + Vm

K + C

где: V(C) - скорость увеличения радиуса колоний грибов (мм/час); C - концентрация клеток бактерий в инокулюме (кл./мл); n - коэффициент нелинейности ингибирования; Kj -константа ингибирования, численно равная концентрации бактерий, при которой достигается половина от максимального эффекта ингибирования; Vx - остаточная скорость роста гриба при бесконечной концентрации бактерий; Vmax - кинетический параметр, отражающий скорость роста гифов, в отсутствии бактерий, и в сумме с Vx, численно равный максимальной скорости роста данного гриба.

Графическое отображение описанной модели представлено на рисунке 4 на примере Fusarium oxysporum var. lini на среде с различными концентрациями Pseudomonas sp. B-

6798.

о

о и

&

о о ер о и

о


0,0005 0,0500 5,0000 500,0000 50000,0000 5E6 5E8

0,0050 0,5000 50,0000 5000,0000 5E5 5E7 5E9

концентрация бактериальных клеток в инокуляте, кл./мл

Рисунок 4 - Зависимость скорости роста колоний гриба Fusarium oxysporum var. lini от концентраций бактериальных клеток Pseudomonas sp. B-6798

Примечание. На представленном рисунке кривая соответствует теоретическому расчету, а в виде точек -практически полученные данные.

Полученные показатели ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями позволяют количественно оценить интенсивность антагонизма между ними (K и V j). Чем ниже константа ингибирования, тем чувствительней гриб к данной бактерии и наоборот, чем



она больше, тем менее чувствителен к бактерии гриб. Анализируя Vx можно говорить о том, насколько полно подавляют рост гриба изучаемые виды бактерий.

Таким образом, апробированные и разработанные простые модели искусственных экосистем с ограниченным количеством звеньев являются эффективным инструментом для изучения законов функционирования микробных популяций и их сообществ в природных экосистемах. При разработке подходов устойчивого развития биосферы экспериментальные и теоретические исследования позволяют выявить закономерности взаимодействия микробных популяций с высшими растениями и почвенными грибами и найти подходы к управлению ими в моделях искусственных экосистем.

Литература

1. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. - М.: Мир, - 1989. - 692 с.

2. Боронин А. М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений Соросовский образовательный журнал. - 1998. - №10. - С. 25-31.

3. Генгель П. А. Физиология растений с основами микробиологии. - М.: Просвещение, 1965. - 584 с.

4. Евдокимов Е.В. Динамика популяций в задачах и решениях: Учеб. пособие. - Томск: Томский государственный университет, 2001 - 73 с.

5. Ермолова Н.И., Иванова Н.И., Скворцова Н.П. и др. Биопрепараты на основе ризосферных псевдомонад Защита и карантин растений. - 1992. - № 9. - С. 24-25.

6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, 1976. - 438 с.

7. Минаева О. М., Акимова Е. Е. Использование искусственных экосистем в качестве моделей для изучения и реализации устойчивого развития в агрофитоценнозах Вестник ТГУ. Приложение. Материалы международных, всероссийских и региональных научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ. - 2005. - № 13. - С. 107-109.

8. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: МИП, 1978. -

331 с.

9. Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных процессов. - Изд-во МГУ, 1993. - 302 с.

10. Сидоренко О. Д. Действие ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйственных культур Агрохимия. - 2001. - № 8. - С. 56-62.

11. Смиряев А.В., Мартынов С.П., Кильчевский А.В. Биометрия в генетике и селекции растений [Электрон. ресурс]: ЦНБ им. Н.И. Железнова / МСХА им. К.А. Тимирязева. -Электрон. издание. - Режим доступа: http: library.timacad.ru , свободный.

12. Соколов М.С. Состояние, проблемы и перспективы применения экологически безопасных пестицидов в растениеводстве Агрохимия. - 1990. - № 10. - С. 124-145.

13. Сомова Л. А. Функциональная и индикаторная роль гетеротрофных микроорганизмов в искусственных экосистемах: Автореф. дисс. ... доктор биол. наук - Красноярск, 1999. -

86 с.

14. Benizri E., Baudoin E., Guckert A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria [Электрон. ресурс]: Biocontrol science and technology. - Электрон. журн. - 2001.

- Vol. 11. - P. 557-574. - Режим доступа: http: article.pubs.nrc-cnrc.gc.ca, свободный.

15. Dijkstra A.F., Scholten G.H.N., Van Ven J.A. Colonization of wheat seedlings (Triticum aestivum) by Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis Biology and fertility of soils. - 1987.

- № 4. - P. 41-46.

16. Geoffrey W. Zehnder, John F. Murfy, Edward J. Sikora, Joseph W. Kloper. Application of rhizobacteria for induced resistance wheat [Электрон. ресурс]: European journal of plant pathology. - Электрон. журн. - 2001. - Vol. 107. - P. 39-50. - Режим доступа: http: www.ag.auburn.edu, свободный.

17. Krasilnikov N.A. Soil microorganisms and higer plants [Электрон. ресурс]. - Moskow: Published by the Academy of Siences of the USSR, 1958. - Режим доступа: http: www.soilandhealthe.org, свободный.



18. Meena B., Radhajeyalakshmi R., Marimuthu T. et al. Biological control of groundnut late leaf spot and rust by seed and foliar applications of powder formulatin of Pseudomonas fluorescens Biocontrol science and technology. - 2002. - № 12. - P. 195-204.

19. Nelson L.M. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Prospects for new inoculants [Электрон. ресурс]: Online. Crop Management. - Электрон. База данных. - 2004. - Режим доступа: http: www.plantmanagementnetwork.org, свободный.

20. Nielsen T.H., Thrane C., Christophersen C. Structure, production characteristics and fungal antagonism of tensin - a new antifungal lipopeptide from Pseudomonas fluorescens strain 96.578 Journal of applied microbiology. - 2000. - № 89. - P. 992-1001.

21. Palleroni N.I. Introduction to the Family Pseudomonaceae The Procaryotes. - Berlin, Heidrlberg, New York: Springer-Verlag, 1981. - Vol.1. - Р. 655-665.



© 2017 РубинГудс.
Копирование запрещено.