На правах рукописи УДК 581.1:547.281.2+577.1

РОГОЖИН Василий Васильевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ГИПОБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

http: zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf Работа выполнена в лаборатории исследования биологически активных

веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Официальные оппоненты: академик ААО, профессор,

доктор биологических наук И.Э. Илли,

доктор биологических наук Ю.М. Константинов, доктор химических наук А.А. Семенов.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 19 апреля 2000 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д.003.25.01. по защите докторских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 а/я 1243. СИФИБР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан 10 февраля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Акимова Г.П.

Иркутск 2000

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Гипобиоз - это состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая и высокая температуры, отсутствие влаги и т.д.), при сохранении их высокой жизнеспособности. Однако после восстановления нормальных условий для существования организмов происходит возобновление активной деятельности всех его функциональных систем. В реализации гипобиотических состояний используются адаптационные механизмы, обусловливающие приспособление к условиям окружающей среды растений и животных, которые заложены в их анатомо-морфологические, молекулярно-генетических и физиолого-биохимических особенностях строения. В основе действия механизмов покоя проявляется функционирование различных физиолого-биохимических процессов. Регулирование этих процессов осуществляется комплексом биологически активных веществ, которые участвуют в росте и развитии растительного организма, обеспечивая сохранение его жизнеспособности. Вхождение в состояние покоя сопровождается понижением активности биосинтетических процессов и дыхания митохондрий, последнее вызывается разобщением окислительного фосфорилирования, переключением аэробных метаболических процессов на анаэробные (Скулачев, 1994). При этом скорость протекания анаэробных метаболических систем начинает преобладать над активностью аэробных процессов. Показателями анаэробных метаболических процессов могут служить ферменты глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа, а аэробных - пероксидаза. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа является ключевым ферментом пентозофосфатного пути превращения углеводов, катализирует реакции окисления глюкозо-6-фосфата в присутствии NADP, который необходим для метаболизма липидов (жирных кислот и стероидов) (Путилина, 1982). При этом известно, что стероидные гликозиды могут в организме выполнять роль антиоксидантов, регулировать проницаемость мембран и активировать процессы деления и роста клеток (Богатский и др., 1960; Кинтя, 1988). Алкогольдегидрогеназа катализирует обратимые реакции окисления алифатических спиртов с участием NAD (Sund, Theorell, 1963). Отношение концентраций альдегида к спирту отражает уровень протекания анаэробных биоэнергетических процессов. Снижение этого соотношения должно сопровождаться активацией катаболических процессов, а повышение -углублением гипобиотического состояния (Кершенгольц, 1 991 ). Однако этот регуляторный механизм в семенах культурных и дикорастущих растений недостаточно изучен.

Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности

пероксидазы, которая совместно с СОД и каталазой входит в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов, предотвращающих разрушительное действие активных форм кислорода (Fridovich, 1 986; Halliwell, 1982). Фермент способен катализировать реакции окисления различных биологически активных соединений (NADH, ИУК, аскорбиновая кислота, флавоноиды и др.), среди которых следует выделить антиоксиданты, соединения

способные подавлять образование свободных радикалов, ингибировать ПОЛ. Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами

должна наблюдаться взаимная зависимость, которая, к сожалению, недостаточно изучена.

Семена культурных растений в отсутствие воды и при низкой температуре находятся в состоянии вынужденного покоя. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие (Николаева и др., 1985). Период прорастания делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка (Обручева, Антипова, 1997). Известно, что для нормального прорастания в воздушно-сухих семенах должны присутствовать все компоненты белок-синтезирующей системы: рибосомы, тРНК, факторы инициации и элонгации, аминокислоты и аминоацил-тРНК-синтетазы, все ферменты метаболизма, белки теплового шока и их мРНК (Гумелевская и др., 1 995). Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей. В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода (АФК): О2-, Н2О2, НО-, НОС1 и др. (Ursini et al., 1989). Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран (Rubanyi, 1 988; Allen, Balin, 1 989). Супероксидные радикалы модифицируют белки, нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества (Коган и др., 1 992). Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов (Бурлакова и др., 1991). Контроль за содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты. В генерировании свободных радикалов может принимать участие и пероксидаза. Однако инициирующая роль фермента в процессах прорастания семян практически не изучена. Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов. УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами антиоксидантной системы (Рогожин, Курилюк, 1 996). Однако взаимодействие их основных метаболитов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний у живых организмов, обитающих в экстремальных условиях мало исследовано. Поэтому актуальность и значимость изучения биохимических механизмов формирования

гипобиотических состояний позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить закономерности протекания основных метаболических процессов и роль антиоксидантной системы при формировании гипобиотических состояний.

Электронный журнал ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ -3В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить физико-химические свойства пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ растений; выявить особенности структурной организации каталитических центров этих ферментов и способы реализации заложенных в них адаптационных возможностей, которые могут проявляться при формировании гипобиотических состояний.

2. Провести сравнительный анализ кинетических свойств ферментов в зависимости от функционального состояния и видовой принадлежности растительного организма.

3. Изучить участие пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ и их метаболитов в обеспечении устойчивости и поддержании высокой жизнеспособности семян дикорастущих и культурных растений.

4. Исследовать влияние высоких положительных температур на резистентность и всхожесть семян растений, выявить отличительные особенности в проявлении ферментативной активности у семян культурных и дикорастущих растений при действии стрессирующих факторов.

5. Исследовать влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы, а также роль малых доз ультрафиолетового излучения на динамику активности ферментов зерновок пшеницы.

6. Изучить роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в сезонной динамике развития растений.

7. Изучить закономерности взаимного влияния компонентов антиоксидантной системы при прорастании семян.

8. Установить роль аскорбиновой кислоты в механизмах формирования гипобиотических состояний.

9. Изучить возможности регулирования глубины гипобиотического состояния с помощью варьирования концентраций антиоксидантов.

Научная новизна. Проведенные исследования дают описание общих закономерностей пероксидазного окисления антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, кверцетина, дигоксина и др.) в реакциях индивидуального и совместного окисления. Показано, что в действии пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, который позволяет в реакциях совместного окисления повышать скорость пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата более чем на два порядка, тогда как избыток антиоксидантов понижает активность фермента. Предложено, что данный механизм может быть использован в живых организмах при формировании гипобиотических состояний. При этом пероксидаза может являться показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах. Активность фермента увеличивается при прорастании семян, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления их покоя. Поэтому антиоксиданты (аскорбиновая кислота и гидрохинон) в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их

совместном присутствии могут активировать фермент, увеличивая скорость протекания метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Показано, что АДГ, Г6ФДГ и пероксидаза участвуют в адаптационных механизмах растений, произрастающих в экстремальных условиях. При этом ферменты необходимы, прежде всего, для сохранения жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием. При прорастании происходит интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. Причем у непроросших семян, остающихся в покое, активность АДГ возрастает, а пероксидазы понижается, в то время как в прорастающих семенах отмечается обратная зависимость, что свидетельствует об активном участии фермента в формировании пусковых механизмах прорастания семян пшеницы. В реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и в проростках пшеницы, а антиоксиданты накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, избыток которых может ингибировать фермент. Взаимное влияние компонентов АОС реализуется в пинг-понг -механизме. При этом в процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация, что может проявляться в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью системы антиоксидантной защиты. Поэтому действие низких положительных температур на семена во время их замачивания, характеризующееся изменением активности пероксидазы и содержанием АО в прорастающих семенах и проростках пшеницы, может свидетельствовать о проявлении реактивности проростков на действующий фактор. Следовательно, в совокупности эти показатели могут быть предложены в качестве критериев адаптированности проростков к стрессирующим факторам.

Сформулированные в работе научные положения развивают новое направление в исследовании механизмов эмбриогенеза, состоящее в выявлении закономерностей функционирования антиоксидантной системы при формировании гипобиотических состояний и на начальных этапах прорастания семян.

Практическая значимость работы. В результате исследований в соответствии с тематическими планами академии и Министерства сельского хозяйства Республики Саха (Якутия), разработана научно-обоснованная программа использования биологически активных веществ в предпосевной обработке семян для повышения урожайности злаковых культур. Раскрыты особенности протекания биохимических адаптационных механизмов растений при действии на них стрессирующих факторов (УФ-облучение, температура).

Разработан высокочувствительный и селективный метод спектрофото-метрического титрования активных центров алкогольдегидрогеназы ртуть

содержащими соединениями (HMB, CMB), для исследования функциональной роли SН-групп в механизме действия фермента.

Предложено использовать при проведении лабораторных исследований усовершенствованные способы определения содержания сердечных гликозидов пикратом натрия (заявка на изобрет. N 9511 5784), концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (патент РФ N 211 2241 , общего содержания антиоксидантов в биологическом материале (патент РФ N 97111918), общей антиокислительной активности (патент РФ N97111917)), содержания флавоноидов в биологическом материале (патент РФ N 97111 921 ) и антиокислительной активности биологического материала (заявка на изобрет. N

96114003).

Разработаны эффективные способы иммобилизации биологически активных веществ экстрактов растений на биогенном носителе (патент РФ N

2112241 и заявка на изобрет. N 97104995).

Материалы научных исследований использованы при создании простого, чувствительного и специфического метода определения этанола в биологических жидкостях и выдыхаемом воздухе на основе выделенного и стабилизированного препарата алкогольдегидрогеназы из семян пшеницы (а.c.CCCР, N 1666956).

Для сельскохозяйственного производства предложены два способа консервации эерна на фураж (патенты РФ N 2111677, N 2111676), способ консервации кормов двухуглеродными соединениями (патент РФ N 1 800954) и четыре способа консервации пантов оленя органическими соединениями

(патенты РФ N 95121681, N 95121684, N 95121119 и N 96104419), которые

обеспечивают длительное сохранение в зерне, зеленой массе и в пантах северного оленя функционально активных веществ.

Предложено для повышения урожайности зерновых культур насыщать семена различными ксенобиотиками, что способствует повышению их посевных качеств и сопротивляемости семян и растений к экзогенным патогенным факторам (действию низкой и высокой температуры, микробам и др.). Выявлена наиболее оптимальная продолжительность замачивания семян в растворах БАВ - четыре часа. Замачивание семян в течение этого времени не наносит им существенного вреда и не влияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в первые два часа способствует повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяй-ственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и урожайности.

Результаты исследований отражены в учебных пособиях, которые используются при чтении лекционного курса и при проведении лабораторно-практических занятий по предмету Биологическая химия , проводимых в Якутской государственной сельскохозяйственной академии. Защищаемые положения. 1. Молекулярные механизмы, заложенные в структуре ферментов (пероксидаза, алкоголь- и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы), обуславливают их избирательное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний. 2. Состояние гипобиоза

обеспечивается за счет поддержания высокой активности ферментов анаэробных процессов, а выход из состояния покоя обусловлен активацией ферментов аэробных процессов, среди которых инициирующая роль принадлежит пероксидазе; продукты окисления фермента могут активизировать процессы ПОЛ, вследствие этого возрастает интенсивность дыхания, а, следовательно, реализуется выход системы из состояния покоя. 3. Компоненты антиокислительной системы принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний, а их взаимное влияние, обеспечивает поддержание нормальной жизнедеятельности семян в состоянии покоя, при прорастании и при действии на них стрессирующих факторов. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, всероссийских и республиканских съездах, симпозиумах и конференциях: IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), III Всесоюзном научном симпозиуме Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине (Ленинград, 1 980), III Всесоюзной конференции по химии и биохимии порфиринов (Самарканд, 1 982), IV Всесоюзном симпозиуме Инженерная энзимология (Киев, 1 983), XI Всесоюзном симпозиуме Биологические проблемы Севера (Якутск, 1 986), Международном конгрессе ИСТА (Новосибирск, 1 990), Первой международной конференции Знание - на службу нуждам Севера (Якутск, 1 996), II съезде Биохимического общества (Москва, 1 997); Международном симпозиуме Химия и химическое образование АТР, 21 век (Владивосток, 1997); Межвузовских конференциях преподавателей физиологии и биотехнологии растений (Москва, МСХА, 1 994, 1 997); региональной научной конференции Северо-восток России: проблемы экономики и народонаселения (Магадан, 1 998), II и III Циркумполярных сельскохозяйственных конференциях (Тромс, Норвегия, 1995; Анкоридж, Аляска, США, 1998), IV и V Международных конференциях Регуляторы роста и развития растений (Москва, МСХА, 1997, 1 999), IX Международном симпозиуме по новым кормовым растениям (Сыктывкар, 1 999), 6-и региональных конференциях, теоретических семинарах Якутского института биологии, Якутской государственной

сельскохозяйственной академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 88 печатных работ, в том числе 31 статья, 1 5 патентов, 3 положительных решения на заявки и учебное пособие. Материалы легли в основу шести научных отчетов. Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 468 страницах машинописного текста, включает 39 таблиц, 93 рисунка, а также список цитируемой литературы из 540 наименований. Диссертация состоит из введения, 1 0 разделов, заключения, выводов и приложения.

Список используемых сокращений. АДГ - алкогольдегидрогеназа, АО -антиоксиданты, АК - аскорбиновая кислота, АОА - антиоксидантная активность, АОС - антиокислительная система, Г6ФДГ - глюкозо-6-

фосфатдегидрогеназа, ИЦДГ-NADP - изоцитратдегидрогеназа NADP-зависимая, ИУК - индолил-3-уксусная кислота, ОДН - о-дианизидин, СМВ -хлор- и HMB -гидроксимеркурибензоат, G6P - глюкозо-6-фосфат, ПОЛ -перекисное окисление липидов, ПО - пероксидаза, СГ - сердечные (стероидные) гликозиды, МДА -малоновый диальдегид, ТБК -тиобарбитуровая кислота, УФ - ультрафиолетовое излучение, СФ - строфантин.

Материал и методы исследования

Основными объектами исследований служили различные по происхождению семена пшеницы (Triticum aestivum L.) и травянистые растения, выращенные в разные годы в условиях Республики Саха (Якутия) (опытные поля ИБПК СО РАН и Якутского НИИСХ).

Влажность, всхожесть, жизнеспособность семян злаковых культур определяли по методам Гостстандартов СССР: всхожесть - ГОСТ 1 2038 - 66; жизнеспособность - ГОСТ 12039-66; сила роста - ГОСТ 12040-66; влажность -ГОСТ 1 2041 -66 и бобовых (караганы древовидной) - (ГОСТ 1 3056.6-75). Жизнеспособность семян исследовали тетразольно - топографическим методом (Методические указания по определению жизнеспособности семян тетразольно-топографическим методом. Л.:ВИР, 1980).

Семена пшеницы (Triticum aestivum L.), овса (Avena L.), ячменя (Hordeum L.) и караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.) предварительно замачивали в растворах БАВ в течение 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри. Число семян в одной чашке - 100, число повторностей в каждом варианте - 4, число опытов - 4.

Перекисное окисление липидов в семенах индуцировали полным светом ртутно-кварцевой лампы БНПО2-30-001У3,5 ( Спектр-2 , Россия) с интенсивностью энергетического облучения 30 Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от облучаемого объекта (max=254 нм).

Для анализа продуктов ТБК 1 г сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного этанола, полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g.

За накоплением продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида - следили по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, £=155 мМ-1 см-1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0,5 мл экстракта последовательно добавляли 0,5 мл 1 %-ного раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор НС1 и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 1 0 мин. Реакцию останавливали путем охлаждения пробы при температуре 15оС в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5-1 0 мл 96%-ного этанола. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контрольные пробы инкубировали параллельно с опытными, в которые добавляли вытяжку и ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в мкмоль/г или нмоль/г сухой массы.

Определение антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1 987). В пробирку последовательно вносили 2,2 мл 50%-ного этанола, 0,4 мл

экстракта, 0,1 мл 25 мМ раствора о-фенантролина, а затем после перемешивания по каплям приливали 0,3 мл 123 мМ раствора FeCl3 и выдерживали в темноте 10 мин. Оптическую плотность измеряли при 505 нм. Для построения калибровочного графика использовали кверцетин. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мг/г сухой массы.

Концентрацию пероксидазы определяли спектрофотометрически по поглощению при 403 нм (£=102 мМ-1 см-1 (Ogewa et al., 1979) или с использованием пиридингемохромогена (Falk, 1964).

Хроматографию нативной и модифицированной пероксидазы на СМ-целлюлозе проводили, нанося 5 мл раствора фермента (1 мг/мл) в 5 мМ №-ацетатном буфере (рН 5,0) на колонку с СМ-целлюлозой (1Х12 см), предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили в линейном градиенте концентрации ацетатного буфера (рН 5,0) от 0,005 до 1,5 М (объем смесителя 1 00 мл, скорость злюции 22 мл/ч).

Активность нативной и модифицированной пероксидазы определяли при 22оС по начальной скорости окисления в их присутствии о-дианизидина перекисью водорода (Лебедева и др., 1977). К 2,1 мл 0,01 М №-фосфатного буфера, содержащего 0,1 М КМ33 (рН 7,0), добавляли 0,2 мл 5 нМ раствора пероксидазы и 0,1 мл 0,43 мМ о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 1 6 мМ Н2О2. Окисление о-дианизидина регистрировали по увеличению поглощения раствора при 460 нм (£=30 мМ-1 см-1 ). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль о-дианизидина за 1 мин.

Реакцию окисления АК (2,2-352,0 мкМ) и гидрохинона (1,0-1,6 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25оС в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,0-6,0, или натрий-фосфатного, рН 6,0-8,0, буферов, в присутствии пероксидазы хрена. Окисление АК регистрировали по уменьшению поглощения при 265 нм, £=7,0 мМ-1 см-1 (Досон и др., 1991), а гидрохинона при 290 нм, £=2,2 мМ-1 см-1. За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (аскорбиновой кислоты или гидрохинона) за 1 мин.

Активность АДГ в прямой реакции определяли по скорости окисления этанола и образования NADH при 340 нм (£=6,22 мМ-1см-1). К 2,2 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера рН 10 добавляли 0,1 мл 36 мМ раствора NAD и 0,1 мл 0,41 М раствора этанола. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 2,5 мкМ раствора АДГ. Активность АДГ в реакции восстановления ацетальдегида наблюдали при 340 нм по убыли NADН в процессе реакции. В кювету вносили 2,2 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера рН 6,0, добавляли 0,1 мл

раствора NADН 11,3 мМ и 0,1 мл 2,5 мкМ фермента. Реакцию инициировали 0,1 мл 0,1 М раствора ацетальдегида. За меру активности фермента принимали количество микромолей NAD восстановленного или окисленного за 1 мин.

Активности NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и дегидрогеназы 6-фосфоглюконовой кислоты определяли по (Путилина, 1 982), содержание стероидных гликозидов - по

соединениям относятся аскорбиновая кислота, кверцетин, гидрохинон, стероидные гликозиды, ИУК.

Показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. В механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. Установлено, что при связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток АК понижает каталитическую активность фермента.

Исследованные антиоксиданты (дигоксин, гидрохинон, кверцетин и аскорбиновая кислота) могут ингибировать пероксидазное окисление быстро окисляемого субстрата о-дианизидина, катализируемое пероксидазой хрена. Дигоксин связываясь с фермент-субстратным комплексом, в котором образуется стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, ингибирует пероксидазу по антиконкурентному типу. Проявляя свойства антиоксиданта дигоксин подавляет свободнорадикальное окисление о-дианизидина. Кверцетин ингибирует пероксидазу по смешанному типу. При связывании с ферментом кверцетина понижается сродство и эффективность превращения о-дианизидина. Наблюдаемый эффект отмечается за счет того, что кверцетин является медленно окисляемым субстратом пероксидазы, скорость окисления которого в присутствии быстро окисляемого субстрата возрастает, что и создает конкуренцию. Аскорбиновая кислота при индивидуальном окислении является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. Однако в присутствии быстро окисляемого субстрата наблюдается их дифференцированное окисление. Причем АК окисляется полуокисленным промежуточным фермент-субстратным комплексом пероксидазы аналогично ферроцианиду. Скорость пероксидазного окисления АК в присутствии ОДН может превышать скорость индивидуального окисления аскорбиновой кислоты более чем на два порядка, а о-дианизидина - в 1 ,5-2,0 раза.

Результаты исследования имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывают регуляторную роль антиоксидантов в пероксидазном окислении быстро окисляемых субстратов. Выявленные закономерности позволяют предположить, что увеличение содержания антиоксидантов в исследуемом биообьекте может ингибировать пероксидазу, тогда как возрастание концентрации фермента будет способствовать быстрому их окислению.

При совместном окислении АК и гидрохинона, осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами пероксидазы почти на два порядка лучше, чем связывание гидрохинона. Таким образом, предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако связавшись гидрохинон не оказывает влияния на связывание второй молекулы АК, что проявляется в неконкурентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект

(Ермаков, 1 987), аскорбиновой кислоты - по (Полевой, Максимова, 1 978).

Концентрацию АДГ находили спектрофотометрически по спектру поглощения комплекса фермента с NAD в присутствии пиразола (Einarsson et al., 1 976) или с помощью титрования хлор- и гидроксимеркурибензоатом (Рогожин и др., 1988).

Спектральные измерения выполняли на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы Varian (США). Кажущиеся константы скорости реакций окисления субстратов пероксидазы, АДГ и Г6ФДГ определяли из данных по стационарной кинетике (Березин, Клесов, 1 976).

При расчете каталитических констант использовали пакет прикладных программ по анализу и обработке кинетических данных ферментативных реакций. Все полученные количественные результаты подвергнуты статистической обработке с учетом критерия Стьюдента при р<0,05-0,01 . Статистическую ошибку средней определяли по методике (Лакин, 1 990), используя ППП Снедекор V2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Молекулярные механизмы регулирования активности ферментов основных метаболических процессов гипобиоза

В действии ферментов живых организмов заложены сложные регуляторные механизмы, управление которыми позволяет обеспечивать выполнение определенной функции, возложенной на данный фермент в клетке. Знание этих механизмов позволяет разобраться в особенностях действия ферментов, направленных на выполнение их специализированной функции в живом организме.

Нами изучены физико-химические свойства пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, которые являются ключевыми ферментами метаболических процессов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний.

Пероксидаза относится к гемсодержащим белкам, активный центр которой представлен преимущественно гидрофобными аминокислотными остатками (Газарян и др., 1 997). Нами изучено строение активного центра фермента, установлена природа функциональных групп, участвующих в катализе. Показано, что вблизи активного центра располагаются функционально важные карбоксильные группы, модификация которых влияет на каталитические свойства фермента, в частности, на процесс переноса электронов с органического субстрата - донора водорода - на промежуточные формы Е1 и Е2 полуокисленные соединения пероксидазы. В то же время модификация этих групп не оказывала влияние на скорость окисления неорганического субстрата пероксидазы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в механизме действия фермента могут быть реализованы различные пути переноса электрона с субстрата на железо гема.

По скорости окисления субстраты пероксидазы можно разделить на быстро и медленно окисляемые. Однако особое значение приобретает исследование реакций пероксидазного окисления функционально важных соединений, обладающих полифункциональным действием. К таким

всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии могут активировать фермент, увеличивая скорость протекания метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Для подтверждения высказанных предположений возникает необходимость в проведении экспериментов по изучению влияния антиоксидантов на механизмы прорастания семян, что и было сделано нами в дальнейших исследованиях, описанных ниже.

Индолил-3-уксусная кислота входит в группу природных фитогормонов -ауксинов. Наиболее богаты содержанием ИУК растущие части растительного организма: верхушки стебля, молодые части листьев, почки, завязи, прорастающие семена, пыльца (Якушкин, 1 993). В конце роста растяжением усиливается лигнификация клеточных стенок, накапливаются ингибиторы фенольной природы и абсцизовая кислота, возрастает активность пероксидазы и оксидазы ИУК, снижающие общее содержание ауксина в тканях (Grierson, Covey, 1984). Участие пероксидазы в этих процессах обусловлено тем, что ИУК является субстратом фермента. Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород. Исследование механизма окисления ИУК пероксидазой растений показало, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина (Park, 1987; Metodiewa et al., 1992), который может находиться в составе дистального домена фермента (Савицкий и др., 1998). Пероксидаза катализирует окисление ИУК как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола (Gazaryan, et al., 1996, Савицкий и др., 1998).

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и индолил-3-уксусная кислота связывается в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывается на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным. Это может наблюдаться вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора.

Используя ИУК можно предположить место расположения участка связывания молекул АК в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком также является дистальная область активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата. Тогда как при связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК,

проявляется при рН 5,5-7,0. Оптимум активирования приходится на рН 7,0. Высокие концентрации АК ингибируют фермент как в реакциях индивидуального, так и совместного с гидрохиноном пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Причем, если в реакциях индивидуального окисления АК фермент ингибируется при рН 6-7 6-9 молекулами субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Пероксидаза хрена способна катализировать окисление органических соединений не только перекисью водорода, но в отдельных случаях и кислородом воздуха (Березин и др., 1975). Высказывается предположение, что для выполнения столь разнообразных функций у фермента имеется два различных активных центра (Siegel, Galston, 1967). В некоторых реакциях для проявления каталитической активности пероксидазе требуются ионы металлов, таких как Mn, Zn, Cu, Ca и др. или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с ферментом. Появление ответной реакции пероксидазы на различные соединения, которые могут активировать или ингибировать фермент позволяет отнести его к числу регуляторных (Андреева, 1 988). Поэтому активирование пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты высокими концентрациями субстрата и гидрохинона позволяет предположить наличие вблизи активного центра регуляторного участка, связывание с которым субстратов может повышать или понижать активность фермента.

Следует особо подчеркнуть биологическое значение наблюдаемого эффекта активации пероксидазы в реакциях окисления медленно окисляемого субстрата в присутствии быстро окисляемого и ингибирование активности фермента высокими концентрациями субстрата. Выявленные закономерности позволяют понять механизм действия большого количества соединений, используемых в предпосевной обработке семян и обладающих стимулирующим, ретардантным, ингибирующим действием в отдельности, а также в различных сочетаниях (Михно и др., 1997). Пероксидаза входит в состав ферментов катализирующих окисление различных соединений, используемых в аэробных метаболических процессах, интенсивность которых возрастает в процессе набухания и прорастания семян. До сих пор спорными являются вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения всхожести семян высокими концентрациями веществ. На основании полученных данных мы можем предложить механизм участия пероксидазы в этих процессах. Так как фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, активность которого увеличивается при их прорастании, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижению

активируя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, ускоряет протекание в прорастающих зерновках пентозофосфатного цикла превращения углеводов, и тем самым создаются условия для ускорения синтеза стероидов и информативных молекул (ДНК и РНК).

Поддержание высокой жизнеспособности семян, в период вынужденного покоя, обеспечивается за счет слаженной работы ферментов анаэробных процессов. Одним из таких ферментов является алкогольдегидрогеназа, состоящая из двух субъединиц. Фермент характеризуется широкой специфичностью, действует на алифатические и ароматические спирты (первичные и вторичные), альдегиды, на ароматические кетоны (Кочетов, 1 980).

Основными субстратами АДГ являются этанол и ацетальдегид, превращение которых протекает в присутствии восстановленного и окисленного

NAD.

к(кат1) fc

СН3СН2ОН + NAD СН3СНО + NADH

к(кат2)

к(кат1), к(кат2)- каталитические константы реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида соответственно.

Нами показано, что высокие концентрации этанола и NAD способны активировать АДГ в интервале рН 6,0-7,9. Предложен механизм активации АДГ, основанный на существовании отрицательной кооперативности субъединиц фермента по связыванию этанола и NAD. Показано, что благодаря отрицательной кооперативности субъединиц АДГ является саморегулирующейся системой и обладает адаптационной мобильностью к повышению концентрации этанола. При низких концентрациях этанола фермент хорошо его связывает и, не обладая высокой каталитической активностью, не образует в высоких концентрациях ацетальдегид. При больших концентрациях этанола фермент активируется. Благодаря этому клетка получает возможность быстрее перерабатывать этанол, повышая концентрацию ацетальдегида, который может способствовать углублению гипобиотического состояния. Поэтому выявленные закономерности в действии АДГ могут реализоваться для обеспечения длительного поддержания покоя семян.

В качестве кофактора АДГ может использоваться и NADP, восстановленная форма которого (NADPH) при рН 6,5 в 2 раза медленнее окисляется, чем NADH, каталитические константы равны 11,2 и 22,5 мин-1 соответственно. При этом NADPH в 2,7 раза хуже связывается с ферментом, чем NADK Окисленные формы NAD и NADP имеют равные при рН 10 значения к(кат1)=40 мин-1, однако NAD связывается в 200 раз лучше, чем NADP. Поэтому в дегидрогеназных реакциях катализируемых АДГ может участвовать в основном восстановленная форма кофермента. Использование ферментом различных коферментов, позволяет предположить об огромных адаптационных возможностях, заложенных в механизме действия АДГ,

что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены, поэтому проявляется неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре создает препятствие для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК. Это, возможно, обусловлено отрицательным кооперативным влиянием различных участков активного центра фермента. Выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление органических субстратов, катализируемое пероксидазой, имеет важное биологическое значение. ИУК, по-видимому, может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемых субстратов, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. Возможно, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК, обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Таким образом, ИУК может выполнять роль триггера в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Действие ауксина может проявляться, например, при выходе семян растений из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая активирует процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания.

В функционировании другого важнейшего фермента гипобиоза - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы нами выявлен сложный регуляторный механизм, который осуществляется за счет действия G6P, NADP и рН на процесс окисления глюкозо-6-фосфата в тройном фермент-субстратном комплексе. Высокие концентрации G6P активируют фермент, а избыток NADP приводит к его ингибированию. В связывании и превращении субстрата и кофермента принимают участие четыре функциональные группы с рК 7,0, 8,0, 9,0 и 9,5. Среди этих групп важнейшее значение имеет группа с рК 9,5, протонирование которой может понизить каталитическую активность, уменьшить активацию фермента избытком субстрата и вызвать ингибирование глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы большими концентрациями NADP. По-видимому, данный регуляторный механизм способствует выполнению важной функциональной роли фермента в обеспечении состояния гипобиоза семян пшеницы и при их прорастании. Выход семян из состояния покоя сопровождается активизацией процессов гидролиза крахмала, в результате чего образуется большое количество G6P, который

метаболические процессы, увеличивающие концентрацию АТФ в проростке, в результате содержание нуклеозидфосфатов начинает накапливаться в системе. Избыточное содержание АТФ в проростках приводит к ингибированию АДГ, что и проявляется в виде понижения активности фермента при прорастании проростков пшеницы. Следовательно, АТФ может выполнять роль регулятора алкогольдегидрогеназной активности, осуществляя направленное переключение процессов с анаэробных на аэробные, при повышении функциональной активности митохондрий.

Выявленные закономерности позволяют предположить, что в действии основных ферментов гипобиоза заложены регуляторные механизмы, которые обеспечивают запрограммированное управление их функциональной деятельностью в нормальных условиях и эти же механизмы начинают проявляться при возникновении условий угрожающих жизнедеятельности системы в экстремальных условиях. Причем регулирование деятельности ферментов, может осуществляться с помощью естественных субстратов метаболических процессов, которые помимо своей основной функции могут в экстремальных ситуациях регулировать активность ферментов, осуществляя направленное протекание метаболических процессов, обеспечивающих формирование гипобиотических состояний.

Таким образом, основные молекулярные механизмы формирования гипобиотических состояний заложены в особенностях структуры ферментов и в регулировании их каталитической активности с помощью субстратов и биологически активных веществ, обладающих полифункциональной деятельностью в клетках живых организмов.

2. Роль ферментов, функционально активных веществ и условий среды в формировании гипобиотических состояний

Сравнение каталитических свойств АДГ семян культурного растения (пшеницы) и дикорастущего (пырея ползучего), позволяет оценить степень участия фермента в формировании устойчивости семян к экстремальным факторам среды и их адаптационный потенциал.

В таблице 1 представлены величины Кт алкогольдегидрогеназ пшеницы и пырея ползучего. Наибольшие различия в значениях констант связывания этанола и ацетальдегида наблюдаются в физиологической области рН 6,0-7,5. Показано, что алкогольдегидрогеназой пшеницы ацетальдегид связывается в 1 0 раз эффективнее этанола, тогда как величины констант связывания кофакторов NAD и NADН различаются незначительно. Алкогольдегидрогеназа пырея ползучего связывает ацетальдегид в 8-1 0 раз лучше этанола, а NADН в 5-8 раз эффективнее по сравнению с NAD.

Такие различия в связывании субстратов этанола и ацетальдегида АДГ пшеницы обеспечивает определенную направленность дегидрогеназной реакции, в которой при физиологических рН осуществляется преимущественное превращение ацетальдегида в этанол и генерация последнего в покоящихся семенах для обеспечения, по-видимому, их энергетических потребностей. В семенах пырея ползучего накопление этанола

которые могут быть реализованы для поддержания высокой жизнеспособности семян с различными формами покоя.

Используя ртутьсодержащие соединения (HMB и CMB) показано, что в активном центре АДГ семян пшеницы имеются функционально важные SH-группы, химическая модификация которых полностью ингибирует фермент. Установлено, что число SH-групп, принимающих участие в катализе равно двум. При этом SH-группы участвуют как в реакциях окисления этанола, так в реакциях восстановления ацетальдегида. Наличие неконкурентного типа ингибирования свидетельствует о том, что связывание ингибитора не происходит в месте связывания субстратов АДГ (этанола и ацетальдегида). Однако связывание ингибиторов вызывает существенные изменения в конформации фермента, в результате чего нарушается нормальное взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Поэтому местом локализации SH-групп, по-видимому, является кофермент связывающий участок, а их модификация HMB и CMB может оказывать влияние как на связывание кофермента, так и на его превращение, проявляясь в смешанном типе ингибирования АДГ ртутьсодержащими соединениями. Использование ртутьсодержащих соединений позволило нам разработать селективный метод титрования активных центров АДГ, что может быть использовано при определении содержания фермента в различных биогенных тканях.

Известно, что АТФ и другие нуклеозидфосфаты способны регулировать активность ключевых метаболических ферментов. К таким ферментам относятся гексокиназа, пируваткиназа, фосфофруктокиназа и др. Поэтому мы изучили влияние АТФ, АДФ и АМФ на кинетику реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида, катализируемых АДГ. Показано, что нуклеозидфосфаты способны конкурентно ингибировать АДГ. Причем АТФ и АДФ сильнее ингибируют фермент в реакции восстановления ацетальдегида чем АМФ. При этом АТФ и АДФ более избирательно действуют на АДГ в реакции восстановления ацетальдегида, что, по-видимому, связано с преимущественным использованием, образующегося ацетальдегида в анаболических реакциях для синтеза функционально активных соединений, активизации аутоиммунных реакций за счет модификации NH2 - и других групп белков и частично для синтеза АТФ. В случае накопления АТФ в чрезмерно высоких концентрациях, нуклеотиды способны ингибировать и прямую реакцию, предотвращая использование ацетальдегида в синтетических процессах, в том числе и в реакциях синтеза АТФ. Следовательно, АДГ семян при физиологических рН преимущественно способна катализировать реакцию накопления этанола, который в покоящихся семенах может выполнять роль основного энергетического субстрата метаболических процессов. За счет генерации этанола в семенах поддерживается их высокая жизнеспособность и длительная сохранность. При этом реакция восстановления ацетальдегида находится под контролем эндогенных нуклеозидфосфатов (АТФ и АДФ), избыток которых, по-видимому, может ингибировать фермент, регулируя таким образом уровень эндогенных этанола и ацетальдегида в семенах, находящихся в состоянии вынужденного покоя. Тогда как при прорастании семян активизируются

Таблица 1. Величины Кт (мМ) реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида алкогольдегидрогеназами семян пшеницы и пырея ползучего при различных рН.

5,8 6,5 7,0 7,5 7,9

8,0 8,5 9,0 10,0 10,7 11,0

АДГ пшеницы

Km NAD

0,42 0,20 0,19

0,35 0,43

0,33

0,18 0,19 0,22 0,34

Ктэтанол

14,3 17,0 20,0 16,0

14,7

15,0 12,0 17,0 20,0

KmNADH

0,13 0,25 0,52 0,54 0,67

20,0

2,0 0,7 1,8 1,6

1,56 40,0

АДГ пырея ползучего

K-m NAD I К^тэтанол

KmNADH Km

0,58 0,32 0,31 0,27

0,29 0,27 0,27 0,86

20,0 11,0 11,0 9,0

14,0 16,0 15,0 13,5

0,11 0,05 0,07 0,13

0,10 0,21 0,14

0,12 -

0,6 1,2 1,0 1,3

8,3 6,0 9,6

может происходить еще интенсивнее, поскольку АДГ способна в 8-10 раз лучше связывать как ацетальдегид, так и NAD Причем связывание NADН алкогольдегидрогеназой пырея ползучего в физиологической области рН (6,07,5) в 7-10 раз эффективнее, чем АДГ пшеницы. При этом особые различия между алкогольдегидрогеназами пшеницы и пырея ползучего наблюдаются в щелочной области рН 8,0-11,0. При этих рН АДГ пырея ползучего связывает NADН в 2-4 раза лучше NAD, а ацетальдегид в 2-3 раза

эффективнее этанола. АДГ пшеницы в этой области рН NADН и ацетальдегид практически вообще не связывает (табл. 1 ).

Показано, что оптимумы каталитических констант алкогольдегидрогеназ пырея ползучего и пшеницы в реакции окисления этанола находятся в области рН 8,0 - 11,5 (рис. 1, кривые 2, 3) с различиями в величинах к(кат1) в 3-4 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ пшеницы имеет оптимум к(кат2) при рН 6,5-7,0, а АДГ пырея ползучего при рН 8,0-9,5 (рис. 1, кривые 1, 4). Причем, если соотношение к(кат2)/к(кат1) АДГ пырея ползучего равно 5-6 во всем физиологическом интервале рН (6,0-8,0), то у АДГ пшеницы оно постепенно понижается приобретая следующие значения при рН 6,0 1 2-1 4, рН 7,0 - 4-5 и рН 8,0 - 0,1 -0,2. Это указывает на то, что за счет особенностей строения каталитического участка активного центра АДГ семян пырея ползучего во всем интервале рН от 6,0 до 9,5 равновесие в системе спирт -альдегид смещено в сторону этанола, тогда как в семенах пшеницы при рН 8,0 равновесие алкогольдегидрогеназной реакции смещено в сторону образования альдегида, содержание которого определяет, по-видимому, глубину гипобиотического состояния семян. Однако при подкислении среды до рН 6,0 равновесие алкогольдегидрогеназной реакции начинает смещаться в сторону образования этанола. При этом в семенах пшеницы это происходит в 2-2,5 раза быстрее, чем в семенах

lgkcat

юр ар pH

Рис. 1. рН - зависимость kcat восстановления ацетальдегида (1,4) и окисления этанола (2,3) алкогольдегидрогеназами семян пшеницы (3,4) и пырея ползучего (1,2). Условия: 23оС, буферные растворы 0,1 М: Na-фосфатные рН 6,0-8,0; глицин/NaOH рН 8,5-11,0. Концентрации: этанол - 1,2-40,0 мМ, ацетальдегид -0,8-16,0 мМ, NAD - 1,44 мМ, NADН - 0,45 мМ, АДГ пшеницы - 0,42 мкМ, АДГ пырея ползучего - 0,2-0,56 мкМ.

пырея ползучего. Последнее, вероятно, определяет повышенную легкость выхода семян пшеницы из состояния покоя по сравнению с семенами пырея ползучего.

АДГ пшеницы и пырея ползучего в реакции окисления этанола имеют температурный оптимум в диапазоне 40-50оС (рис. 2) с разницей максимальных значений к(кат1) в 3,2-3,5 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ пшеницы имеет температурный оптимум к(кат2) в диапазоне 55-60оС (рис. 3), тогда как АДГ пырея ползучего - при 40-50оС. Причем величины каталитических констант (к(кат2)) АДГ пшеницы по ацетальдегиду во всем изученном интервале температур были в 2-1 0 раз выше, чем у пырея ползучего.

Интересно отметить, что в области низких положительных температур (<10оС) величины к(кат2) АДГ пшеницы и пырея ползучего сближаются, а значения к(кат1) АДГ пшеницы остается в 2,5-4,5 раза выше к(кат2) АДГ пырея ползучего. Это, вероятно, связано с тем, что при низких положительных температурах для обеспечения покоя и сохранения потенциальной жизнеспособности и тех и других семян необходимо не только накопление этанола, но и поддержание определенной концентрации ацетальдегида, тем