kcat, мин-1

kcat, мин-1

ю ю so

to,C

Рис.2.Температурные зависимости kcat реакции окисления этанола алкоголь-дегидрогеназами семян пшеницы (1) и пырея ползучего (2). Условия: 0,1 М глицин/NaOH буфер pH 10,0. Этанол-16,4 мМ, NAD-1,44 мМ, АДГ пшеницы - 0,11 мкМ, АДГ пырея ползучего -0,4 мкМ,

to,C

Рис.3.Температурные зависимости kcat реакции восстановления ацеталь-дегида алколгольдегидрогеназами семян пшеницы (1 ) и пырея ползучего (2). Условия: 0,1 М Na-фосфат-

ный буфер pH 7,0. NADH - 0,45 мМ,

ацетальдегид-4,0 мМ, АДГ пшеницы 0,59 мкМ, АДГ пырея ползучего -0,58 мкМ

большей, чем меньше степень гипобиоза семян. Таким образом, при низких положительных температурах для поддержания покоя семенам необходим не ацетальдегид, а преимущественно этанол, который обеспечивает продолжительность гипобиотического состояния в этих условиях.

Существенная разница в реакции восстановления ацетальдегида

алкогольдегидрогеназой пшеницы и пырея ползучего при температурах от 5 до 60оС позволяет предположить, что при более эффективном связывании ацетальдегида АДГ пырея ползучего скорость его превращения в активном центре фермента (в особенности при низких температурах) в 5-1 0 раз медленнее, чем АДГ пшеницы. Это позволяет накапливать ацетальдегид в семенах пырея в большей степени, чем в семенах пшеницы, что, по-видимому, определяет более высокую степень гипобиоза семян пырея, меньшую скорость их прорастания, зато повышает их адаптивный потенциал.

Таким образом, в семенах злаковых растений отношение содержания ацетальдегида к этанолу отражает уровень протекания анаэробных биоэнергетических реакций, понижаясь при активации катаболических процессов и повышаясь при формировании гипобиотических состояний. Для проверки высказанных предположений мы изучили влияние экзогенной

обработки семян различными концентрациями этанола и ацетальдегида на их жизнеспособность и устойчивость к стрессирующим факторам среды.

С помощью 1 0 мМ растворов этанола мы предприняли попытку вывести из состояния покоя семена пшеницы сорта Якутянка 224, жизнеспособность которых по тетразолиевому методу была 1 00, а лабораторная всхожесть - 68%. Испытывались методы замачивания семян в 1 0 мМ растворе этанола при 4 и 20оС с последующим выдерживанием на воздухе при 4оС. Лучшие результаты, всхожесть 1 00%, были получены при инкубации семян 1 5 ч в 1 0 мМ растворе этанола при 4оС с последующим выдерживанием их на воздухе 4,5 ч также при 4оС. То есть в этом случае этанол усилил эффект холодовой стратификации семян.

Семена пырея ползучего, относящегося к дикорастущим злакам, могут находиться длительное время в состоянии послеуборочного покоя. Они имели высокую жизнеспособность (77+3%), но низкую всхожесть (12+2%). При замачивании в 1 0 мМ растворе этанола при комнатной температуре всхожесть семян увеличивалась в 1 ,5 раза, а дополнительное выдерживание их при температуре 4 - 5оС повышало всхожесть в 2,5 раза.

Таким образом, малые концентрации этанола могут активизировать ростовые процессы и увеличивать всхожесть жизнеспособных семян как культурных, так и дикорастущих растений.

Выявив на физиологическом уровне положительное влияние низких концентраций этанола и ацетальдегида на жизнеспособность и всхожесть семян, мы попытались изучить некоторые биохимнческие механизмы этого явления.

Если подойти к вопросам сохранения и повышения жизнеспособности семян растений с позиций биоэнергетики, то можно предположить, что жизнеспособность семян базируется на сохранении на оптимальном уровне активности катаболических дегидрогеназных и аэробных систем. Поэтому мы изучили изменения активности ряда ключевых дегидрогеназ и пероксидазы на ранних этапах прорастания семян, при длительном хранении и влияние на них различных экзогенных концентраций этанола и ацетальдегида.

В покоящихся семенах пшеницы активности АДГ и пероксидазы соизмеримы (рис. 4). При прорастании семян с появлением корней и побегов активность АДГ резко снижается к шестому дню практически до нуля, а активность пероксидазы повышается в надземной части в 1 ,8-2,0, в корнях в 1 21 4, а в зерне в 4-5 раз.

В покоящихся семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная урожая разных лет изучены активности не только пероксидазы и АДГ, но и некоторых других резервных катаболических и анаболических дегидрогеназ: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и NADP-зависимой изоцитратдегидрегеназы. Как видно из результатов, приведенных в табл. 2, с понижением жизнеспособности семян коррелирует уменьшение активности изученных дегидрогеназ, а снижение активности пероксидазы - с понижением всхожести семян. Полученные данные позволили сделать вывод, что дегидрогеназы, в том числе и АДГ, необходимы прежде всего для сохранения

УАДГ, мкмоль/мин-г Vro, мкмоль/мин-г

о г н б ь

Время, дни

Рис. 4. Активность АДГ (1) и пероксидазы зерен (2) проростков (3) и корней (4) пшеницы сорта Якутянка 224 в зависимости от времени проращивания.

Таблица 2. Активность ферментов (мкмоль/мин г сухой массы) семян пшеницы сорта Скороспелка улучшенная в зависимости от сроков сбора урожая.

Таблица 3. Активность АДГ и пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в жизнеспособных прорастающих и находящихся в состоянии покоя семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная.

Мы предположили, что малые концентрации этанола или ацетальдегида оказывают свое влияние именно на эти механизмы.

Результаты, приведенные в табл. 4, подтверждают сделанное предположение. Увеличение всхожести семян пшеницы наблюдается в тех случаях, когда обработка малыми концентрациями этанола способствует активации пероксидазы и снижению активности АДГ. Тогда как активация пероксидазы, не сопровождающаяся уменьшением активности АДГ (50 - 65 мМ ацетальдегид), приводит к снижению всхожести. В случае если отмечается совместное уменьшение активности пероксидазы и АДГ, то это может служит показателем снижения жизнеспособности семян.

жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием. Далее при прорастании происходят интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. При этом резкое возрастание активности пероксидазы может свидетельствовать о том, что фермент участвует в активизации пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободнорадикального окисления, которые через активизацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной активности митохондрий.

Для проверки высказанного предположения был проведен следующий эксперимент. Семена пшеницы сорта Скороспелка улучшенная (всхожесть- 44, жизнеспособность - 70%) проращивались в течение трех дней и дифференцировались на проросшие и непроросшие семена. У семян этих двух групп определялась активность АДГ и пероксидазы. Из табл. 3 видно, что у непроросших семян активность АДГ возрастает на 1 3-21 %, а пероксидазы почти не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается снижение активности АДГ на третий день прорастания в 5,4 раза при увеличении активности пероксидазы в 2,0 раза. Эти результаты указывают, на то что для прорастания семян необходима

не просто активация всех биоэнергетических процессов, а переключение дегидрогеназных реакций на аэробные.

Известно, что устойчивость живого организма зависит как от природы, так и интенсивности и продолжительности действия стрессирующего фактора. При условии, если компенсаторные силы организма способны противостоять воздействию, то метаболическая система организма после окончания воздействия возвращается к исходному уровню, быстро восстанавливая возникшие нарушения, мобилизуя свой адаптационный потенциал. Однако, если воздействие выходит за рамки толерантности биологической системы, то это может приводить к серьезным структурным нарушениям, без возможности последующей регенерации нарушенных метаболических процессов, завершающихся гибелью организма.

Для проверки выдвинутых предположений нами изучена резистентность и реактивность семян пшеницы сорта Якутянка 224 и караганы при температуре 65оС. Воздействию подвергались семена караганы 95-97 и пшеницы 98-100%-ной жизнеспособности. Показано, что процент всхожих семян пшеницы в течение 6-ти часов воздействия колеблется в пределах 78-98 (рис. 5,а), с резким понижением всхожести семян в конце температурного воздействия до 35-38%. У караганы отмечены колебания во всхожести в пределах 20-92, с понижением до 5-8% (рис. 5,б). Тогда как жизнеспособность семян пшеницы снижается после 6-ти, а караганы - 3-х часов температурного воздействия (рис. 5). При этом активность АДГ пшеницы в течение 6-ти часов изменялась в пределах 2,9 - 3,3 мкмоль/мин г

А, % а А, % б

О 2 Ч б 8 0 268

Время, ч

Рис. 5. Влияние температуры (65оС) на всхожесть (1 ) и жизнеспособность (2) семян пшеницы сорта Якутянка 224 (а) и караганы (б).

(рис. 6,а), с возрастанием в конце воздействия до 3,5 мкмоль/мин г, а активности пероксидазы - 3,5-4,3, с понижением в конце до 0,9 мкмоль/мин г. У караганы отмечались аналогичные колебания в активности АДГ и пероксидазы, но с более значительными отклонениями в 26,5 - 31 ,8 и 23,5 - 31 ,4 мкмоль/мин г соответственно (рис. 6,б). В конце воздействия активность АДГ соответствовала 28, а пероксидазы - 0,1 5 мкмоль/мин г.

В зависимости от продолжительности стрессового воздействия, представленного на рисунке 5, на кривой всхожести семян можно выделить три временных периода. В начальный период, продолжительностью 1 ,5-2 часа, отмечается повышение всхожести семян пшеницы на 1 0-1 8, а у караганы на 2745% от исходной, в этот период отмечается снижение активности как АДГ, так и пероксидазы (рис. 6). Во второй период, продолжительность которого обычно составляет 4-5 часов, всхожесть семян может как повышаться, так и понижаться, причем у пшеницы она колеблется в пределах 75-98, а у караганы - 1 5-75%. При этом, как видно из рис. 5, жизнеспособность семян в этот период поддерживается на высоком уровне и не подвержена сильным изменениям. Однако активности ферментов в этот период приобретают колебательный характер, причем в семенах караганы активность АДГ может повышаться до 24,0-32,0, а пероксидазы - 0,1 -3,6 мкмоль/мин г. Тогда как в зерновках пшеницы активность АДГ изменяется от 0,4 до 2,7, а пероксидазы - 2,0-4,0 мкмоль/мин г. В третий период, продолжительностью 1 -2 часа, в семенах пшеницы и караганы отмечается резкое падение как всхожести, так и жизнеспособности, при этом наблюдается незначительное повышение активности АДГ и понижение активности пероксидазы. В этот

Таблица 4. Влияние обработки семян пшеницы сорта Скороспелка улучшенная растворами этанола и ацетальдегида на их жизнеспособность, всхожесть, активность АДГ и пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) на 4-тые сутки после начала проращивания.

--.-1 I I I -1--1-1-1-1-г

О 2 V 6 8 0 2 Ч в

Время, ч

Рис. 6. Динамика активности алкогольдегидрогеназы (1) и пероксидазы (2) (мкмоль/мин г сухой массы) семян пшеницы сорта Якутянка 224 (а) и караганы (б) от времени их прогрева при температуре 65оС.

период сила действующего фактора, возможно, выходит за пределы толерантности организма и компенсаторные механизмы семян не способны регенерировать возникшие нарушения, вследствие чего наступает их гибель.

Таким образом, воздействие температуры может приводить к резким изменениям в протекании метаболических процессов в покоящихся семенах. Причем, у семян караганы реактивность на температуру оказывается выше, чем у семян пшеницы, что выражается в более резких колебаниях во всхожести семян и активности ферментов, но устойчивость к температуре ниже, что отмечается в значительном понижении как всхожести семян, так и активности изученных ферментов.

Известно, что процесс набухания семян и последующий рост надземной части и корней проростков, сопровождаются активацией аэробных метаболических процессов. Условиями для прорастания всех семян являются достаточная влажность, доступ кислорода и благоприятная температура (Николаева и др., 1985). По мере поступления воды в семена в них активизируются метаболические процессы. Причиной положительного влияния кислорода на прорастание семян может быть активизация и поддержание на достаточном уровне процессов дыхания, а также активное окисление веществ, тормозящих процесс прорастания (Якушкина, 1 993). Поступающий в митохондрии кислород инициирует протекание окислительного фосфорилирования, обеспечивающего синтез АТФ. Наличие которого будет определять интенсивность анаболических (синтетических) процессов.

Нами изучена динамика активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и пероксидазы семян пшеницы сорта Приленская 1 9 в

течение 24 часов набухания. Показано, что в увеличении активности ферментов отмечается индивидуальная периодичность, зависящая от их природы и места локализации. Аналогичная периодичность в увеличении скорости биосинтеза макромолекул была отмечена на 6-9-м и 1 4-20-м часах прорастания семян гороха (Калинин, 1986). Поэтому наблюдаемая нами периодичность активности ферментов, возможно, обусловлена интенсивностью процессов биосинтеза белков, в том числе и ферментов, и активностью протеолитических ферментов, осуществляющих гидролитическое расщепление белков в клетке.

Наибольшая активность ферментов отмечается в зародыше, а затем по убывающей в щитке и эндосперме. Величины максимальной активности Г6ФДГ, АДГ и пероксидазы в зародыше выше активности ферментов эндосперма в 5, 20, 9,7, а щитка - 3,5, 6, 7,9 раз соответственно.

Показано, что малые дозы УФ-излучения могут изменять активность ферментов в зерновках пшеницы со сдвигом их экстремумов на более раннее время. При этом максимальная активность АДГ и пероксидазы эндосперма понижается на 1 7-30 и 8-27, щитка - 78-82 и 80-90, зародыша - 75-86 и 70-75 процентов соответственно, при незначительном, всего на 1 0-25%, снижении активности Г6ФДГ в этих частях семян пшеницы. При снижении общей активности АДГ и пероксидазы в зародыше в 3-4, а в щитке - 5-6 раз. Вероятно, в семенах подвергнутых УФ-излучению скорость протеолиза возрастает преимущественно в щитке и зародыше, а в эндосперме, возможно, из-за наличия высокого содержания антиоксидантов, способных ингибировать свободнорадикальные реакции и таким образом предотвращать разрушение лизосом и выход протеаз, скорость протеолиза может несколько понизиться. Возрастание протеолиза в зерновке после УФ-облучения семян пшеницы приводит к понижению активности АДГ и пероксидазы в щитке в 3-7, 2,5-6 и зародыше - 1 ,3-1 ,5, 3-5 раз соответственно. Одной из причин увеличение протеолиза в щитке и зародыше, по-видимому, является возрастание концентрации гидролитических ферментов из поврежденных ультрафиолетом лизосом.

Выход из покоя семян обуславливается интенсивностью биосинтетических процессов прежде всего в зародыше и щитке семян пшеницы. Снижение этих процессов может приводить к понижению всхожести и энергии прорастания зерновок практически до нуля, что мы наблюдали у пшеницы сорта Скороспелка урожая 1983 года. Хотя жизнеспособность зерновок пшеницы сохранялась на уровне 56-60%.

Таким образом, малые дозы УФ-излучения, провоцируя свободнорадикальные реакции могут изменять скорость синтетических процессов в семенах, ускорять биосинтез ферментов в начальный период набухания. Особенно это заметно для мембранных структур, к которым относится щиток. Понижение активности дегидрогеназ и оксидаз в щитке приводит к утрате его функциональной активности, что, возможно, сказывается на его избирательную регуляторную функцию и в целом на всхожесть зерновок пшеницы.

О

32 J

б

-28-

а

/ а

1-1-1-г

1- -Г

б

46 0Я

го гн

Время, ч

Рис. 7. Динамика накопления малонового диальдегида (а) и антиоксидантов (б) в эндосперме (1 ), зародыше (2) и щитке (3) семян пшеницы сорта Приленская 1 9 от времени набухания. Условия: 23оС; среда набухания - дистиллированная вода.

система семян полностью контролирует уровень ПОЛ. Возрастание ПОЛ отмечается на 1 0 и 24 ч прорастания семян и связано с увеличением АОА (r=0,79). УФ-облучение вызывает в прорастающих семенах пшеницы колебания ПОЛ и АОА, интенсивность которых зависит от времени воздействия (рис. 9). Динамика ПОЛ в проростках уже после минутного УФ-облучения семян пшеницы принимает выраженный колебательный характер

Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов (Гумилевская и др., 1997). УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами антиоксидантной системы. В инициировании ПОЛ может принимать участие пероксидаза. Действие фермента заключается в том, что субстратами ПО являются органические вещества, окисление которых приводит к образованию в организме свободных радикалов. Контроль за уровнем ПОЛ осуществляется с помощью антиоксидантов, которые также могут окисляться в пероксидазных реакциях. Таким образом, между исследуемыми компонентами должна наблюдаться взаимная зависимость, которую и предстояло выяснить в дальнейших исследованиях.

На рис. 7 показана динамика накопления малонового диальдегида и антиоксидантная активность в зародыше, щитке и эндосперме в процессе набухания семян пшеницы в дистиллированной воде. В течение 24 часов набухания в различных частях семени отмечается плавное возрастание АОА только в эндосперме в 3,3 раза, зародыше - 2,7 раза, а в щитке отмечается понижение антиоксидантной активности на 22-35% (рис. 7,б). Хотя АОА щитка была в начале набухания выше в 1 2 раз, чем в эндосперме и в 2 раза зародыша. Повышенная АОА в эндосперме и зародыше обеспечивается возрастанием содержания антиоксидантов, способных подавлять свободнорадикальные процессы, что проявляется в своеобразной динамике ПОЛ в этих частях семени. Причем уровень ПОЛ находится в обратной зависимости и возрастает в эндосперме в 2,2 раза, зародыше - в 3,3 раза, с резким увеличением в щитке в 7,2 раза (рис. 7,а). Из приведенных данных видно, что наиболее активно деструктивные процессы протекают в щитке семени пшеницы, что, возможно, имеет важное биологическое значение в пусковом механизме при выходе семян из состояния покоя. Можно предположить, что активация ПОЛ в щитке приводит к нарушению структуры его мембран, вследствие этого создается возможность поступления из эндосперма веществ, повышающих ростовую активность зародыша.

Известно, что низкая температура понижает скорость прорастания семян. В непроросших семенах пшеницы уровень ПОЛ и АО ниже, чем в проросших. Сравнивая значения содержания МДА и АО приведенные в таблице 5 видно, что у непроросших семян и семян пшеницы выдержанных при 5оС эти показатели мало различаются. Таким образом, низкий уровень ПОЛ служит критерием проявления малой активности АФК, при этом по величине ПОЛ и содержанию антиоксидантов можно определять жизнеспособность семян пшеницы. Семена с высоким уровнем ПОЛ и низким содержанием АО всегда способны хорошо и быстро прорастать.

После 24 ч набухания при 20°C семена пшеницы начинают активно прорастать, что проявляется в активизации процессов пролиферации, завершающиеся через 1 6-24 ч формированием проростка пшеницы. Нами изучено содержание малонового диальдегида и антиоксидантов в прорастающих семенах пшеницы после 24 ч замачивания в дистиллированной воде (рис. 8). Видно, что в процессе прорастания антиоксидантная

Таблица 5. Содержание малонового диальдегида (нмоль/г сухой массы) и антиоксидантов (мкг/г сухой массы) в непроросших семенах пшеницы сорта Приленская 19 во время проращивания в зависимости от температуры.

с возрастанием на 4, 1 2 и 22 ч (r=0,5). При этом АОА в первые часы прорастания семян понижалась, а затем к 1 8 ч повысилась. После 5 мин УФ-облучения в прорастающих семенах активность антиоксидантной системы вначале прорастания уменьшается, но к 1 8 ч возрастает в 1 ,5-1 ,8 раз (r=0,5). Ультрафиолетовое облучение семян в течение 1 0, 1 5 и 20 мин вызывает одновременное увеличение к 6, 1 2 и 1 8 ч как уровня ПОЛ, так и антиоксидантов (r=0,5-0,92). Повышение ПОЛ в прорастающих семенах

МДА, нмоль/г сухой массы

АО, мкг/г сухой массы zoo

Время, ч

Рис. 8. Динамика МДА (1 ) и АО (2) в семенах пшеницы сорта Приленская 1 9 в течение первых суток проращивания. Условия: 22оС, время замачивания семян пшеницы 24 ч, среда замачивания и проращивания - дистиллированнная вода.

а

б

4 в \2 \ь 20 гм ц 8 \г ль го гм

в

г

Время, ч

5 0 1

д

Рис. 9. Влияние УФ-облу-чения семян пшеницы сорта Приленская 19 на содержание малонового диальде-гида (1 ) и антиоксидантов (2) в первые сутки проращивания. Время УФ-облучения

семян пшеницы, мин: а-1 , б-

5, в-1 0, г-1 5, д-20. По оси

ординат значения соответствующих параметров в %, за 1 00% приняты значения МДА и АО семян, не подвергавшихся УФ-облучению. Условия те же, что на рис. 8.

Время, ч

всегда, независимо от времени УФ-облучения, находится под контролем антиоксидантной системы, влияние которой проявляется на 1 6-20 ч прорастания семян пшеницы повышением уровня антиоксидантов в 3-5 раз. Однако при продолжительном УФ-облучении в семенах вырабатываются компенсаторные механизмы противодействующие образованию свободных радикалов в прорастающих семенах пшеницы, использующих кроме антиоксидантов еще, возможно, и другие механизмы подавления ПОЛ, поскольку после 1 5-20 мин УФ-облучения в прорастающих семенах содержание малонового диальдегида может понижаться несмотря на то, что АОА в них может быть даже ниже уровня контроля.

Таким образом, на основании полученных данных можно высказать предположение, что контроль за уровнем ПОЛ во время набухания и прорастания семян пшеницы, осуществляется с помощью низкомолекулярных антиоксидантов, содержание которых связано с уровнем ПОЛ в зерновках. После УФ-облучения в семенах возрастает уровень ПОЛ. Понижение свободнорадикальных процессов в семенах возможно за счет синтеза большого количества антиоксидантов, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно, в зародыше семян пшеницы. Т. е. отмечается активация АОС в ответ на УФ облучение, проявляемое суперпродукцией антиоксидантов.

Выявленные закономерности, по-видимому, являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать глубину покоя семян. Уменьшение содержания антиоксидантов, обеспечивает быстрый выход семян из состояния покоя, тогда как накопление антиоксидантов способствует углублению гипобиотического состояния семян пшеницы.

Для определения степени влияния УФ-облучения на дальнейший рост и развитие проростка нами была изучена динамика накопления малонового диальдегида и содержания интегрального количества антиоксидантов в процессе прорастания семян в течение первых 8 дней. Поскольку нас интересовало содержание продуктов ТБК и антиоксидантов в первые дни прорастания семян, когда только начинает формироваться корневая система и надземная часть проростка растения, то в дальнейшем показатели ПОЛ и АО определялись суммарно в проростке, корнях и эндосперме (рис. 1 0). Из рисунка 1 0 видно, что содержание МДА и антиоксидантов в проростках в процессе прорастания семян различается. Накопление антиоксидантов в проростках происходит значительно медленнее, чем увеличение содержания продуктов ТБК. В первые пять дней прорастания проростка перекисное окисление липидов возрастает в 7 раз, а содержание антиоксидантов увеличивается всего в 2-2,5 раза. Плавное возрастание содержания антиоксидантов, возможно, связано с тем, что на начальных этапах прорастания проростков активность ПОЛ в них подавляется за счет резервного количества АО, которые накапливаются в семенах в период их формирования осенью. Синтез новых антиоксидантов требует больших энергетических затрат, которые возможны только при активной работе фотосинтетического аппарата проростка, что возможно только в более поздние сроки.

Динамика ПОЛ и содержание антиоксидантов в проростках пшеницы было изучено на 4-7 день их проращивания. Количество МДА и антиоксидантов в зеленых семядолях колебалось в пределах 1 00-284 и 68-1 59, корнях - 87-1 00 и 38-117, а в эндосперме - 100-174 и 65-100 процентов соответственно. Значения малонового диальдегида в эндосперме и корнях проростков пшеницы различаются незначительно, в пределах 26,3-45,7 и 46,6-53,5 нмоль/г сухой массы соответственно, тогда как в зеленых семядолях концентрация МДА в 4-1 5 раз выше и колеблeтся от 219 до 623 нмоль/г сухой массы. Содержание антиоксидантов в эндосперме - 0,379-0,579, корнях - 0,65- 1 ,98, зеленых семядолях - 2,06-4,79 мг/г сухой массы. Показано, что изменение концентрации малонового диальдегида в проростках всегда находится в обратной зависимости от содержания в них антиоксидантов. Причем скорость ПОЛ, определяемая в различных частях растения (зеленых семядолях, корнях и эндосперме зерна) различна. Наиболее высокий уровень ПОЛ и антиоксидантов наблюдается в надземной части проростков, а затем по убывающей в корнях и эндосперме.

Известно, что ультрафиолетовое излучение является инициатором активации процессов ПОЛ в растительных и животных тканях (Sonne, 1 929, Рощупкин, 1 980). Эффект действия УФ-излучения связан с нарушением целостности мембран клеток вследствие повреждения липидов и, в частности, ненасыщенных жирных кислот. Любой живой организм реагирует на УФ-излучение, причем степень выраженности ответной реакции определяется заложенными в нем адаптационными возможностями. Реакция организма на воздействие может подразделяться в зависимости от силы и длительности действия раздражителя на два этапа - срочной и долговременной адаптации

МДА, нмоль/г

400 300 -200 . 4Q0

АО, мг/г

2 б г

Дни прорастания

Рис. 10. Изменение содержания малонового диальдегида (1) и антиоксидантов (2) в проростках пшеницы сорта Приленская 19.

(Меерсон, 1986). Срочный этап адаптации возникает непосредственно после начала действия раздражителя, реализуется на базе готовых, ранее сформировавшихся механизмов. Тогда как долговременный этап адаптации инициируется продолжительным воздействием стрессирующего фактора и на основе многократной реализации срочной адаптации. При действии УФ-излучения важное значение для организма имеет мобилизация компенсаторных механизмов. Среди них повышенное внимание предъявляется регуляторным механизмам антиоксидантной системы, целенаправленное действие которых позволяет выживать организмам даже в самых экстремальных условиях. Одним из компонентов таких механизмов является перекисное окисление липидов, реализуемое в организме за счет активации свободнорадикальных процессов, интенсивность которых определяется по количеству образовавшегося малонового диальдегида, хотя малоновый

диальдегид - не единственный ТБК-активный продукт. Развитию спонтанного перекисного окисления липидов в тканях препятствуют, содержащиеся в них антиоксиданты.

Таким образом, по интенсивности протекания перекисного окисления липидов в различных органах можно оценивать неспецифические адаптационные возможности организма, а по содержанию антиоксидантов судить о его компенсаторном потенциале. Причем эти два показателя обычно взаимосвязаны и взаимозависимы.

На рисунке 11 представлены данные по содержанию продуктов ТБК и антиоксидантов в проростках пшеницы, семена которых с влажностью 5-6% подвергались ультрафиолетовому облучению в течение 1 0-ти часов, с периодичностью отбора проб в течение первого часа через 1 , 5, 1 0, 1 5, 20, 30 и 60 мин, а затем каждый час. В течение всего времени УФ воздействия изученные показатели (ПОЛ и АО) претерпевают фазовые изменения. Первые 20 мин УФ облучения семян (рис. 11 ,А-Д) вызывает последующее резкое снижение содержания продуктов перекисного окисления липидов в проростках и максимальное возрастание процессов, ингибирующих образование супероксидных радикалов, что проявляется в увеличении интегрального состава антиоксидантов в первые 2-3-и дня их роста. Продолжение воздействия ультрафиолетового излучения на семена в течение 0,5-1 часа приводит к дальнейшему возрастанию компенсаторных механизмов, что проявляется во временной нормализации в проростках показателей ПОЛ и АО (рис. 11 ,Б,Е, кривые 1 ,2). Однако уже 2-3-х часовое УФ-облучение семян продолжает стимулировать дальнейшее накопление в них свободных радикалов, что выражается в возрастании в проростках пшеницы в первые три дня как ПОЛ, так и антиоксидантов, после чего эти показатели также синхронно снижаются (рис. 11 ,Б,Е, кривые 3,4).

Воздействие УФ-излучения на семена более 4-х часов (рис. 11,В,Г, Ж,З) сопровождается активизацией компенсаторных механизмов, что способствует подавлению в первые дни роста проростков пшеницы в них перекисного окисления липидов до уровня 40-60% от контроля, за счет увеличения содержания антиоксидантов на 20-50%. Однако в дальнейшем динамика ПОЛ в проростках начинает приобретать выраженный колебательный характер. Полученные данные полностью согласуются с концепцией Е. Б. Бурлаковой о взаимосвязанной регуляции свободнорадикального окисления липидов и антиокислительной активности.

Таким образом, реализация компенсаторных механизмов в семенах, подвергшихся воздействию (температура, УФ-облучение), зависит от активности системы антиоксидантной защиты (пероксидаза, АО, ПОЛ). Кратковременное действие фактора может активизировать компенсаторные механизмы, за счет которых в семенах происходит ускоренный синтез функционально активных веществ, которые могут выполнять функции антиоксидантов и одновременно ускорять процессы роста и деления клеток, способствуя выходу семян из покоя, что проявляется в повышении всхожести семян. Зато продолжительное действие фактора может углублять покой семян, понижая их энергию прорастания и всхожесть, что,

120 . 80. 40 .

№ НО 80 кО

А

В

Ал к

№

80 НО

-I I I

Б

Д

Е

Г

2468 г ь 6 з

Время, дни

160 № 80 кО

Ж

З

№

420 80 ко

s г

Время, дни

6 8

Рис. 11 . Влияние УФ-облучения семян пшеницы сорта Приленская 1 9 на содержание малонового диальдегида (А,Б,В,Г) и антиоксидантов (Д,Е,Ж,З) в их зеленых проростках. Время УФ-облучения семян пшеницы, мин: А и Д - (1 )-1 , (2)-5, (3)-10, (4)-15, (5)-20; Б и Е - (1)-30, (2)-60, (3)-120, (4)-180; В и Ж - (1)-240, (2)-300, (3)-360, (4)-420; Г и З - (1)-480, (2)-540, (3)-600. По оси ординат -значения соответствующих параметров (в %), за 1 00% приняты значения МДА и АО проростков, не подвергавшихся УФ-облучению

Таблица 6. Содержание СГ и АК (мг/1 00 г) в эндосперме и зародыше семян ячменя и пшеницы. Условия: семена замачивали 1 7 часов в воде.

Эти изменения служат подтверждением того, что содержание и состав функционально активных соединений эндосперма может оказывать влияния на интенсивность метаболических процессов в зародыше. Понижение концентрации СГ и АК в эндосперме приводит к замедлению процессов деления и роста клеток зародыша. Это условие реализуется на начальных этапах развития, когда автономность зародыша, отражающее его независимость развития от окружающих тканей, и проявляющееся в способности нормально развиваться вне материнского организма, еще очень слабо выражена и эндогенные функционально активные вещества эндосперма лимитируют дифференциацию и рост клеток (Батыгина, 1987). Для подтверждения высказанных предположений мы исследовали экзогенное влияние СГ на выход семян из состояния гипобиоза и рост проростков. Замачивание и проращивание семян проводили в водных растворах строфантина 0,025-250 мкг/мл. Строфантин может избирательно влиять на всхожесть и рост вегетативной массы проростков. Высокие концентрации строфантина оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян овса и караганы независимо от условий замачивания и проращивания. Тогда как эти же концентрации строфантина на семена ячменя и пшениц сортов Скороспелка и Якутянка 224 оказывают стимулирующее действие. Малые дозы строфантина (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всех видов оказывали преимущественно стимулирующее действие, повышая всхожесть на 1 5-30 и

увеличивая вегетативную массу проростков на 20-25%. Причем следует отметить, что как ингибирующий, так и активирующий эффекты строфантина проявляются особенно сильно при предварительном замачивании семян в растворе. Для семян овса и караганы при замачивании и проращивании в растворе строфантина отмечается ингибирующий эффект, который аддитивно возрастает, если эти два действия производятся последовательно. Активация всхожести семян малыми дозами строфантина наблюдалась, в основном, если семена проращивались в растворе

Таким образом, действие строфантина в отношении семян специфично и избирательно в зависимости от вида растения. Причем накопление СГ в одних, например, в семенах ячменя и пшениц может активировать скорость протекания метаболических процессов и, следовательно, выход их из состояния гипобиоза, тогда как для семян овса и караганы такое повышение

возможно, связано со значительным расходом пластического материала на активирование компенсаторных механизмов и, в частности, системы антиоксидантной защиты.

3. Взаимосвязь между компонентами основных метаболических процессов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний

Состояние гипобиоза семян поддерживается за счет разнообразных регуляторных механизмов, участие в которых принимают различные функциональные соединения, среди которых следует выделить стероидные гликозиды и аскорбиновую кислоту, способных накапливаться в растениях в периоды их активной вегетации, в особенности, в период формирования семян. Проявлением их действия может быть регулирование активности пероксидазы, осуществление контроля за уровнем ПОЛ, участие в окислительно-восстановительных реакциях метаболических процессов растений. Возможно, эти особенности действия СГ и АК в организме могут являться элементами механизмов формирования гипобиотических состояний, что и предстояло доказать в дальнейших исследованиях.

Нами было изучено содержание СГ и АК в набухших и проросших семенах ячменя, пшеницы и красоднева желтого. Замачивание семян в воде в течение суток, приводило к возрастанию стероидов в 1 ,5-5,0 раза и к понижению содержания АК. На 3-4 день проращивания в зеленых семядолях содержание СГ возрастало в 4-5 раз, а в корнях в 2,5-3,0 раза. В непроросших семенах концентрация сердечных гликозидов может колебаться, но в целом всегда имеет тенденцию к понижению. Так, например, у семян красоднева желтого в течение 1 0 дней проращивания в непроросших семенах отмечено возрастание содержания СГ и АК в 5,0-6,5 раза. Однако уже через 30 дней эти показатели у непроросших семян снижаются до уровня контроля.

Таким образом, возрастание содержания СГ всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. Тогда как концентрация АК наоборот в покоящихся семенах всегда выше, чем в активно метаболизирующих. Одной из причин накопления АК в непроросших семенах может быть то условие, что из-за ослабления процессов дыхания в этих семенах интенсивность окислительно-восстановительных процессов резко понижена, поэтому расходование метаболитов этих процессов не происходит.

Изучено содержание СГ и АК в зародыше и эндосперме семян ячменя и пшеницы сорта Якутянка 224 (табл. 6). Показано, что в эндосперме семян ячменя со всхожестью 76% СГ и АК содержится больше на 30 и 37% соответственно, чем в зародыше. Тогда как в эндосперме семян пшеницы с лабораторной всхожестью 28%, но высокой жизнеспособностью (86%) стероидов содержится на 20, а АК на 30% меньше, чем в зародыше.