Популярное

Мифы о звукоизоляции



Как построить дом из пеноблоков



Как построить лестницы на садовом участке



Подбираем краску для ремонта



Каркасные дома из дерева


Главная » Российская академия наук

1 2

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений

На правах рукописи УДК 577.1

ВЕРХОТУРОВ Василий Владимирович

ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ

Специальность: 03.00.12 - Физиология растений 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 1999



Работа выполнена в лаборатории по исследованию биологически активных веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель: кандидат химических наук,

профессор, Рогожин. В. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Романенко А. С.

доктор биологических наук, профессор, академик АН РС(Я) Кершенгольц Б. М.

Ведущая организация: Иркутский государственный

университет им. А. А. Жданова

Защита диссертации состоится 8 декабря 1999 г в 1400 час. на заседании диссертационного совета Д.003.25.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по

адресу:

664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова 132 а/я 1243. СИФИБР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан 1 999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук:

Акимова. Г. П.



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Период прорастания семян делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания семян); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка (Обручева, Антипина, 1997). Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей (Барабой, 1991). В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода: О21, О2-, Н2О2, НО-, НОС1 и др. (Зенков, Меньшиков, 1993). Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки (Дубинина, Шугалей, 1993), нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества (Владимиров, Арчаков, 1 972). Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

При прорастании семян в них генерируются активные формы кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы, состоящей из низко- и высокомолекулярных соединений (Inze, Van Montagu, 1 995). К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др.(Кения и др., 1993). В комплекс высокомолекулярной системы антиоксидантной защиты входят ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др. (Андреева, 1988; Калашникова и др., 1999; Dhindsa et al., 1 981 ). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Бурлакова и др., 1975; Кения и др., 1993). Однако роль антиоксидантов в механизмах покоя и прорастания семян пшеницы мало изучена. Хотя известно, что многие из низкомолекулярных антиоксидантов могут быть субстратами пероксидазы (Андреева, 1 988; Запрометов, 1 993). Являясь компонентами единой антиоксидантной системы растений, низко- и высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать взаимное влияние. Однако механизм этого взаимодействия недостаточно изучен.

Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы растений, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза (Савич, 1 989). Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы (Березин и др., 1975). Активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя (Иванова, Вафина, 1 997). Однако мало изучена роль пероксидазы в механизме действия антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении роли антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы, установлении закономерностей проявления ее реактивности на действие низких температур и биологически активных веществ, а также в раскрытии роли пероксидазы и антиоксидантов в механизмах формирования покоя семян пшеницы. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1 . Изучить количественные закономерности проявления пероксидазной активности в процессе набухания и прорастания семян пшеницы.

2. Исследовать количественные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантов в проростках пшеницы.

3. Установить количественные закономерности проявления индивидуальной реактивности проростков на действие низких положительных температур.

4. Изучить влияние антиоксидантов на каталитические свойства пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления.



5. Выявить закономерности взаимного влияния низко- и высокомолекулярных антиоксидантов, входящих в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов.

6. Исследовать влияние экзогенных антиоксидантов на прорастание и всхожесть семян пшеницы.

Научная новизна. Пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты осуществляется, если с окисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) связываются одна или две молекулы аскорбиновой кислоты. При связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента, тогда как связывание нескольких молекул субстрата ингибирует пероксидазу. При совместном присутствии аскорбиновая кислота и гидрохинон окисляются последовательно. Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как её избыток ингибирует пероксидазу. Показано, что антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции. Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а антиоксиданты, накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов. При этом антиоксиданты могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя, таким образом, общий контроль над деятельностью системы антиоксидантной защиты.

Предложен механизм формирования покоя семян, заключающийся в том, что антиоксиданты в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

Практическая ценность. Установлено, что, насыщая зерна ксенобиотиками можно добиваться повышения их посевных качеств, а также сопротивляемости зерен и растений к экзогенным патогенным факторам. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах функционально активных веществ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Замачивание семян на это время не принесет им существенного вреда и не повлияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и увеличению их урожайности. Защищаемые положения. Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы, что проявляется в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян пшеницы.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы были доложены на совместном заседании кафедры агробиохимии и лаборатории исследования биологически активных веществ ЯГСХА (1997 г), на научно - практической конференции агротехнологического факультета секции Физиология и биохимия растений (Якутск 1997 г), на межвузовской конференции молодых ученых ЯГУ (1 998 г), на семинаре отдела физиологии и биохимии Института биологии ЯФ СО РАН (1 998 г), на семенаре Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (1999 г.), на П-ой Международной конференции Регуляторы роста и развития растений (Москва 1999 г). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста,



состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 12 схем, 39 рисунков и 1 4 таблиц. Список литературы состоит из 265 источников, в том числе 1 24 зарубежных авторов.

Список сокращений: АФК- активные формы кислорода; ПО - пероксидаза; ПОЛ -перекисное окисление липидов; ТБК - тиобарбитуровая кислота; МДА - малоновый диальдегид; АО - антиоксиданты; ОДН - о-дианизидин; АК - аскорбиновая кислота; ГХ -гидрохинон; 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол; УФ-облучение - ультрафиолетовое облучение; АДГ - алкогольдегидрогеназа; Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; kcat, kcat -каталитические константы скорости реакции окисления одной и двух молекул АК соответственно; Р - численная константа; Vm - максимальная скорость; Km - константа Михаэлиса; Km1, Km2 - константы Михаэлиса при связывании одной и двух молекул АК соответственно; n - количество молекул АК, ингибирующих пероксидазу.

Материал и методы исследования

В работе использовали НАД, НАДФ, глюкозо-6-фосфат, пероксидазу - фирмы Reanal (Венгрия), о-фенантролин - фирмы Serva (Германия), тритон Х-100 - препарат фирмы Ferak Berlin (Западный Берлин), этанол очищали перегонкой, о-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме, остальные реактивы соответствовали квалификации о.с.ч.; для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.

Объектом исследования служили семена пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Омская 12. Для индукции перекисного окисления липидов семена с влажность 5-6% помещали под ртутнокварцевую лампу БНПО2-30-001У3.5, (Россия) с интенсивностью облучения 30 Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от семян. Контрольные и опытные (после УФ-облучения) семена вначале замачивали на дистиллированной воде 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23 °С при естественном освещении, смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Число семян в одной чашке - 100.

Для анализа продуктов тиобарбитуровой кислоты и антиоксидантов 1 г семян или сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного раствора этанола, гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g. Супернатант для исследования активности пероксидазы получали аналогично, используя 0.1 М натрий-фосфатный буфер

рН 7.0.

Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, е = 155 мМ-1см-1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0.5 мл супернатанта последовательно добавляли 0.5 мл 1 %-ного раствора тритона Х-100, 0.2 мл 0.6 М НС1 и 0.8 мл 0.06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 1 0 мин. Реакцию останавливали охлаждением при температуре 1 50С 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0.2 мл 5 мМ трилона Б и 5-10 мл 96%-ного этанола. Контролем служила пробирка, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.

Анализ антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1987). К 0.2 мл супернатанта последовательно добавляли 0.2 мл 0.5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0.2 мл 0.2%-ного FeCl3 в 96%-ном этаноле. Затем обьем доводили до 3 мл 96%-ным этанолом и выдерживали 1 0 мин в темноте. Расчет антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мкг/г сухой массы.

Активность пероксидазы определяли при 220С по начальной скорости окисления о-дианизидина или аскорбиновой кислоты перекисью водорода. К 2.0 мл 0.1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), добавляли 0.2 мл раствора супернатанта и 0.1 мл 0.43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле или 0.1 мл 5.5 мМ раствора аскорбиновой кислоты. Реакцию инициировали введением 0. 1 мл 1 6 мМ перекиси водорода. Окисление о-дианизидина регистировали по увеличению поглощения при 460 нм, е = 30 мМ-1см-1



(Лебедева и др., 1977), а аскорбиновой кислоты по уменьшению поглощения при 265 нм, е = 7000 М-1см-1 (Досон и др., 1991). За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина или аскорбиновой кислоты (мкмоль), окисленных за 1 мин 1 г сухой массы. Активность алкогольдегидрогеназы определяли, как описано в работе (Кершенгольц, Рогожин, 1979). Активность глюкозо-6-фосфатдегирогеназы определяли по методике (Рогожин, 1996). Содержание эндогенной аскорбиновой кислоты в семенах определяли по методике (Полевой, Максимов, 1978).

Спектрофотометрические исследования проводили на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы Varian (США).

В таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки, полученные из 4-х отдельных опытов, каждый из которых состоял из четырех повторностей (чашек Петри), статистическую ошибку для средней проводили по методике (Лакин, 1 990), используя ППП Снедекор V2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Состояние антиоксидантной системы при прорастании семян пшеницы

1.1 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при

набухании семян пшеницы

Наличие высокой активности пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Нами изучена динамика активности пероксидазы и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 часов набухания при 50 (I группа) и 230C (II группа). Процесс набухания семян, замоченных в дистиллированной воде, сопровождается возрастанием активности фермента (рис. 1 ).


2,5-1-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,

4 8 12 16 20 24

Время, ч

Рис. 1 . Активность пероксидазы зерен пшеницы сорта Омская 1 2 в зависимости от времени набухания при 50С (1) и 230С (2).

Определены величины каталитических констант пероксидазы зерен пшеницы в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты. Показано, что Km мало изменяется в исследованном диапазоне рН 5-7. Km по о-дианизидину незначительно отличается от константы Михаэлиса, определенной для очищенного препарата пероксидазы хрена фирмы Reanal , тогда как Km по АК в 5-9 раз ниже показателей очищенного препарата. Такие различия можно объяснить присутствием в гомогенате посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты.



Активность пероксидазы и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1.5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре в 1 .5 и 1 .8 раза соответственно (табл. 1 ). Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет уровень устойчивости растений к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза. Фермент может проявлять свойства оксидазы. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя.

Таблица 1 . Биохимические показатели органов семян пшеницы сорта Омская 1 2 после 24 часов замачивания зерен в дистиллированной воде при разных температурах.

Орган

ПО мкмоль/мин г сухой массы

ПОЛ нмоль/ г сухой массы

АО мкг/г сухой массы

Температура, 0С

Сухое зерно

3.70±0.21

3.60±0.25

25.3±1.8

21.8±1.1

85.2±3.2

88.3±3.8

Кожура семени

0.44±0.03

0.25±0.02

23.4±1.5

25.5±1.6

160.7±12.1

176.2±13.4

Эндосперм

0.42±0.03

0.28±0.03

19.6±1.2

20.7±1.3

133.3±6.5

124.3±11.3

Щиток

22.2±0.12

21.7±0.11

256.4±15.2

256.4±18.8

Зародыш

59,3±0.45

39.0±0.32

95.3±5.4

117.4±8.5

398.4±24.7

285.7±21.5

1.2 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при

прорастании семян пшеницы

Активность пероксидазы в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 50 и 230С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы (зерно, надземная часть или корни) (рис. 2). Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы (рис. 2а). Зависимости активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имели вид качелей с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков (рис. 2б). Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. Своеобразная динамика проявлялась в активности пероксидазы корней (рис. 2в).

В корнях семян II группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксидазы и только на 7-ой день отмечался рост. Зависимость активности пероксидазы у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день, с понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность пероксидазы в корнях семян I группы была в 1 .5-2.5 раза выше, чем у корней семян II группы. Нами отдельными экспериментами было показано отсутствие в супернатанте активаторов и ингибиторов пероксидазы. Поэтому мотивацией к повышению активности пероксидазы, по-видимому, является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей (Бурлакова и др., 1 975), вызванных воздействием низких температур.

Поскольку ключевую роль в развитии окислительного повреждения играют активные

формы кислорода: О , Н2О2, НО-, органические радикалы, образование которых наиболее интенсивно протекает в корнях растений (Минибаева и др., 1 997). Увеличение активности пероксидазы может быть вызвано синтезом на холоде в семенах пшеницы новых изоферментов пероксидазы или накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих её синтез, что будет проявляться в возрастании активности пероксидазы (Андреева,1 988). Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут



ингибировать фермент, способствуя, таким образом, увеличению водорода в клетках.

концентрации перекиси

А

60 50 40 30 20 10


140-,

120-

100 -

.* 1

Б


240 200 160 120

В


1 2 3 4 5 6 7

2 3 4 5 6 7

2 3 4 5 6 7

Время прорастания, сут. Рис. 2. Динамика активности пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в зерне (А), надземной части (Б) и корнях (В) проростков пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от их времени прорастания. Семена предварительно замачивали в дистиллированной воде при 50С (1 ) и 230С (2) в течение 24 ч, а проращивали при 230С.

Подтверждением высказанных предположений являются результаты по динамике содержания МДА и АО в корнях и надземной части проростков пшеницы зерен I и II групп (рис. 3). Видно, что показатели уровня ПОЛ и содержания АО находятся в прямой зависимости (r=0,5).

Повышение содержания АО преимущественно сопровождается повышением ПОЛ, тогда как активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов (r=-0,65). В случае увеличения содержания АО отмечается понижение активности пероксидазы, а увеличение активности пероксидазы сопровождается понижением уровня ПОЛ (r=-0,65).

500 400 300 200 100 0

МДА нмоль/г сухой массы А


300 п

200 А

100 А

АО мкг/г сухой массы

Б


х---х


, 1 X

X Г


34567

34567

Время прорастания, сут.

Рис. 3. Влияние температуры замачивания семян пшеницы сорта Омская 1 2 на содержание малонового диальдегида и антиоксидантов в их надземной части (А, Б) и корнях (В, Г) этиолированных проростков. Условия те же, что на рис. 2.



Величины показателей корреляции, возможно, были выше, если бы при проведении анализа учитывалось влияние всех компонентов антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза и т д). Наблюдаемые изменения, возможно объяснить в рамках единого представления о роли пероксидазы и АО, являющихся компонентами антиоксидантной системы, в регулировании процессов перекисного окисления в живых организмах. Пероксидаза способна использовать в качестве субстратов антиоксиданты и перекись водорода. Фермент катализирует реакцию, в которой АО окисляются, а перекись водорода восстанавливается до воды. Однако в высоких концентрациях антиоксиданты способны ингибировать фермент и таким образом способствуют увеличению уровня ПОЛ в клетках. Взаимная регулируемость компонентов антиоксидантной системы позволяет контролировать ПОЛ в живых организмах и поддерживать его на определенном постоянном уровне.

1.2.1 Каталитические свойства пероксидазы проростков пшеницы

Нами изучены каталитические параметры пероксидазы 7-ми суточных проростков пшеницы. В качестве субстратов использовали аскорбиновую кислоту (медленно окисляемый) и о-дианизидин (быстро окисляемый субстрат). Показано, что различия в величинах Km по ОДН пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни) (табл. 2), а также Vm проростков пшеницы семян I и II групп незначительны. Основные изменения наблюдаются у Km по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Km зерен I группы выше в 1 .5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Vm по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1 .5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Km по АК пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, у пероксидазы надземной части проростков этой же группы. Следует отметить различия в показателях Km по ОДН корней пшеницы, которые были в 1 .5-3 раза выше, чем у пероксидазы хрена. Так же можно отметить сильные различия в Km по АК для пероксидазы хрена, и из надземной части и корней проростков пшеницы. У корней пшеницы зерен I и II групп Km по АК в 3-1 3 и 6-1 9 раз ниже соответственно, чем у пероксидазы хрена.

Таблица 2. Величины Km (мкМ) реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты, катализируемых пероксидазой зерен и 7-ми суточных проростков (надземная часть и корни) пшеницы сорта Омская 1 2.

Сухое зерно

Проростки пшеницы

Корни хрена**

Надземная часть

Корни

ОДН

ОДН

ОДН

ОДН

54±2

38±2

62±2

94±3

263±12

22±1

70±2

62±2

33±2

40±2

340±18

59±3

35±2

137±4

115±3

1 6 1 ±9

67±3

51±2

124±4

27±2

45±2

170±8

57±2

30±2

49±2

64±2

33±2

65±2

15±1

67±2

11±1

40±2

190±11

39±1

26±1

12±1

36±2

24±1

52±2

18±1

39±2

12±1

30±1

230±14

зерна

замачивались при 5°С,

пшеницы замачивались при пероксидаза хрена - препарат фирмы Reanal .

Такую высокую разницу в значениях Km можно объяснить, во-первых, за счет того, что в исследованиях были использованы гомогенаты корней пшеницы, содержащие весь спектр изоферментов пероксидазы. Тогда как пероксидаза хрена являлась очищенным препаратом, в составе которого преимущественно изоферменты С и В (Андреева, 1 988). Во-вторых, наличием в гомогенате тканей большого количества антиоксидантов, являющихся субстратами пероксидазы, в присутствии которых скорость окисления ОДН и АК может возрастать (Лебедева, Угарова, 1 996).



1.3 Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от

окислительного стресса.

Поскольку пероксидаза и антиоксиданты входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, то нами изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 день прорастания проростков пшеницы (рис. 4).

<

о

1 х А

700 -

у

(D X

600 -

о

О

о щ

Е о

о <

) ° £

о

О

Б

1000

о

Л

Ч

3 4 5

3 4 5

Время прорастания, сут.

Рис. 4. Динамика содержания антиоксидантов (1,1), активности пероксидазы (2,2) и малонового диальдегида (3,3) в надземной части (А) и корнях (Б) проростков пшеницы сорта Омская 1 2. Предварительно зерна пшеницы замачивали в дистиллированной воде при 50С в течение 24 ч, проращивание проводили при 280С.

Видно, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО на 4-5 сутки понижается в 1.4-1.5 раза, при повышении активности пероксидазы в 1.8 раза. По-видимому, в этот период контроль за уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1.5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1 .5 раза, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижаются в 2.4 и 1.2 раза соответственно.

Таким образом, контроль над уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом известно, что в надземной части больше содержится АО и меньше пероксидазы, чем в корнях проростков пшеницы. Поэтому ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. Тогда как в корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ. Поскольку высокие концентрации АО могут ингибировать пероксидазу, то, по-видимому, накопление или понижение содержания АО в проростках, может регулировать активность фермента.

Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние низкой температуры (+5°С) во время 24 ч набухания зерен на динамику уровня ПОЛ, АО и активность пероксидазы проростков пшеницы в течение 3-5 суток прорастания. Как видно из рис. 5 в основном, наблюдаются взаимозависимые колебания исследованных параметров. При этом в корнях и надземной части понижение активности пероксидазы сопровождается возрастанием уровня ПОЛ, а повышение содержания АО приводит к понижению активности пероксидазы. Понижение активности пероксидазы чаще всего наблюдается при повышении уровня АО, что можно объяснить ингибированием фермента высокими концентрациями антиоксидантов.

о





1 2
© 2017 РубинГудс.
Копирование запрещено.