Популярное

Мифы о звукоизоляции



Как построить дом из пеноблоков



Как построить лестницы на садовом участке



Подбираем краску для ремонта



Каркасные дома из дерева


Главная » Спектроскопическое исследование комплексов

Спектроскопическое исследование комплексов Cu(II) с нативной ДНК

Карасев В.Е. (chemi@online.ru), Бабий А.П., Куликов А.П.

Институт химии ДВО РАН

В настоящее время уже не вызывает сомнений тот факт, что молекула ДНК является одной из главных клеточных мишеней повреждающего действия различных химических агентов и, в частности, соединений металлов.

Известно, что соединения меди (II) обладают мутагенным, канцерогенным и онкостатическим действием, которое связывают с их способностью взаимодействовать с молекулами ДНК [1]. Обнаружено, что комплексные соединения меди (II) в присутствии кислорода и восстанавливающих соединений обладают свойствами химических рестриктаз [2].

Несмотря на значительное количество работ посвященных исследованию взаимодействия меди (II) с нативной ДНК (нДНК), отмечается некоторая противоречивость полученных экспериментальных данных не только для комплексов меди (II) с нДНК, но даже и для комплексов меди (II) c отдельными нуклеотидами. Это является основной причиной того, что в настоящее время существуют несколько правдоподобных, но, тем не менее, противоречивых моделей строения комплексов меди (II) c ДНК [3-5]. Вместе с тем, в известной нам литературе, практически отсутствуют прямые структурные данные о строении и характере химической связи в образующихся комплексах меди (II) c нДНК [6,7].

Целью настоящей работы является изучение строения образующихся комплексов меди (II) c нДНК в растворах с различной ионной силой методами электронной, ЭПР и EXAFS спектроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали следующие препараты: ДНК из морской звезды Asterias amurensis. Содержание в ДНК Г-Ц пар - 41%, белка не более 1%. Сохранность спиральной структуры подтверждена следующими показателями: Тпл = 85,30С, А Т = 11,00С, h = 39%, где Тпл - температура плавления, А Т - интервал плавления биополимера в 0,15 M NaCl, h - гипохромный эффект при термической деспирализации ДНК на длине волны 260 нм. В работе использовали соли натрия марки ОСЧ . Полученные из карбоната меди соли CuCl2-2H2O, Cu(NO)2-3H2O и CuClO4-6H2O дважды перекристаллизовывали из



насыщенных водных растворов. Концентрацию меди (II) в растворах определяли атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре АА-78 фирмы Nippon Jarrell Ash.

Инфракрасные спектры концентрированных водно-солевых растворов нДНК регистрировали на спектрометре Perkin-Elmer FI-IR, используя флюоритовые подложки.

Спектры ЭПР снимали на спектрометре JEX-3BC-X в трехсантиметровом диапазоне длин волн при 77K. Электронные спектры поглощения записывали на спектрометре Shimazu 3400. EXAFS спектры на пропускание K- краев поглощения атомов меди регистрировали на спектрометре, установленном на канале вывода синхротронного излучения ВЭПП-3. Обработку EXAFS - спектров выполняли согласно [8].

Комплекс I Cu(II) с нДНК получали смешиванием охлажденных растворов CuCl2 и нДНК, содержащими 0,001M NaCl. Навеску нДНК растворяли в 0,001М NaCl. Молярную концентрацию нДНК в концентрированных растворах биополимера контролировали определением фосфора в заданном объеме. К 10 мл раствора 0,042 М по фосфору нДНК приливали 10 мл 0,004 М CuCl2. Смесь осторожно перемешивали и выдерживали в течение 48 часов при 40С, затем 12 часов при 250С.

Аналогично получали комплекс II, в котором исходные растворы соли меди и биополимера содержали 0,25 М NaCl. Выбор величины ионной силы обусловлен тем, что согласно [9-10] в ~0,25 М растворе NaCl- основной формой существования иона меди (II) в растворе является ион [Cu(H2O)5 Cl]+.

Сохранность спиральной структуры в образующихся комплексах подтверждалась как ИК-спектрами в области колебаний сахарофосфатной цепи (в интервале 900-1250 см-1 наблюдались характерные для спиральной структуры биополимера полосы поглощения [11]), так и величинами Тпл которые для комплексов I и II равнялись 55,4 и 87,5 0С соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектры ЭПР всех полученных соединений Cu(II) и нДНК характерны для изолированных ионов меди (II) в кристаллических полях аксиальной симметрии (рис. 1). Они могут быть описаны спин-гамильтонианом (СГ), который для случая аксиальной симметрии имеет вид:

H = g Hz Sz + glP( Hx Sx + Hy Sy ) + A JzSz +A±(JxSx + JySy),

где S = 1/2; J=3/2

Строение и ближайшее координационное окружение образующегося в 0,001 M NaCl комплекса Cu (II) нДНК обсуждалось ранее [12]. Уменьшение величины g и увеличение A в комплексе I по сравнению с параметрами СГ для акваиона меди (II)



может свидетельствовать о замещении атома кислорода молекулы воды в первой

координационной сфере меди (II) на атомы азота в плоскости металла (Табл.Г). Сравнение спектров ЭПР комплекса I со спектрами меди (II) в фосфатном окружении свидетельствует о близости параметров СГ:

gll = 2,40 ~ 2,36; gi. = 2,06 ~ 2,08; A = 132 ~ 108 э [13-15] и о возможности

образования октаэдрического окружения только с донорными атомами кислорода фосфатной группы и молекул воды вокруг центрального атома в комплексе I.

Рис.1. Спектры ЭПР комплексов Cu(II) нДНК при 77К: а) комплекс I; б) комплекс II.

Привлечение данных электронной спектроскопии (рис.2) позволяет получить дополнительные данные о строении ближайшей координационной сферы центрального атома в комплексе I. Положение максимума полосы поглощения макс = 722 нм d-d перехода иона Си(П) в комплексе I свидетельствует об образовании вокруг центрального атома хромофорной группы (NO5) [16]. Для комплекса I проведено разложение электронного спектра на гауссовы компоненты по методике Яцимирского К.Б. и




Мальковой Т.В. [17]. Для комплекса I в электронном спектре выделили две полосы поглощения X = 722 и 936 нм.

738 нм


600 1000 1400 Я^нм

Рис.2. Электронные спектры комплексов Cu(II) нДНК: а) комплекс I; б) комплекс II.

Анализ наблюдаемых полос поглощения проводился в соответствии со схемой уровней иона меди (II) в полях разной симметрии, в том числе и в поле вытянутой бипирамиды D4h - наиболее стабильной конфигурации шестикоординированных комплексов меди (II) [18]. C учетом тетрагонально расщепленных для симметрии D4h

2 2 2 2 2 2

уровней Eg = B1g + A1g и T2g = B2g + Eg можно сделать следующее отнесение экспериментальных полос для комплекса I:

2А^ <- 2B1g ( 10700 см-1) и 2Eg - 2B1g ( 13800 см-1 )

Малая разница между энергиями Eg и B1g уровней комплекса I не позволила разложить полосу поглощения в области 700-850 нм на гауссовы компоненты и

определить величину энергии перехода - B1g. Величина отношения частот



поглощения в максимумах двух полос равная 1,29 говорит в пользу конфигурации тетрагональной бипирамиды.

Спектры ЭПР и параметры СГ комплексов I и II представлены на рис.1 и табл.1 и имеют значительное сходство, что может свидетельствовать об одинаковом строении ближайшей координационной сферы меди (II) - (NO5). Так как при д 0,25 взаимодействие биополимера происходит с однозарядным ионом [Cu(H2O)5Cl]+, то не исключено образование комплекса хромофора (О50), имеющего весьма близкие параметры спин-гамильтониана (см. Табл. 1) [10]. В электронном спектре комплекса II наблюдается широкая полоса поглощения с макс 738 нм, что свидетельствует об образовании в комплексе II хромофорной группы (NO5), так как макс для хромофорной группы (O5Cl) составляет 820 нм [9].

Табл.1.

Параметры СГ комплексов Cu( II) с нДНК при 77 K.

Соединение

комплекс I

2,360

2,07

0,856

комплекс II

2,359

2,06

0,844

комплекс II(NO3-)

2,365

2,06

0,845

комплекс II(ClO4-)

2,362

2,06

0,850

[Cu (H2O)6 ]2+

2,415

2,07

0,865

[CU (H2O)5 Cl]+

2,367

2,07

0,831

Для уточнения положения Cl- иона в координационной сфере центрального атома комплекса II, нами получены комплексы II (NO3-) и II (ClO4-), как описано ранее с использованием вместо CuCl2-2H2O и NaCl нитратов Cu(NO3)2 -3H2O и NaNO3 и перхлоратов Cu(ClO4)2-6H2O и NaClO4 для комплекса II(NO3-) и II (ClO4-) соответственно.

Электронные спектры комплексов II, II-(NO3-) и II-(ClO4-) практически одинаковы, макс=738 нм. Широкая асимметричная полоса поглощения в видимой области спектра всех трех комплексов II является суммой близко лежащих полос d - d переходов, которую мы не смогли разложить на гауссовы компоненты. Это может свидетельствовать о том, что искажение октаэдрической симметрии в комплексах II невелико.

EXAFS спектры комплекса I нами были изучены ранее [12]. В табл.2 представлены данные о межатомных расстояниях в комплексах I и II.



Табл.2

Межатомные расстояния в комплексах меди (II) c нДНК

Соединение

d, A

комплекс I

Cu - O

1,97

комплекс I

Cu - N

2,25

комплекс I

Cu - O акс.

2,61

комплекс II

Cu - O,N экв.

2,02

комплекс II

Cu - О акс.

2,56

комплекс II

Cu - Р

3,19

На рис.3 представлена кривая F(R) - модуль Фурье-преобразования радиальной структурной функции Х(К), описывающая радиальное распределения атомов (РРА) в комплексе II. Отсутствие существенных различий в кривых РРА для комплексов II, полученных в хлоридных, перхлоратных и нитратных растворах в интервале 1.8<R<4 А позволяет исключить участие Cl- иона в образовании как первой, так и второй координационной сферы центрального атома. Это согласуется с данными электронной и ЭПР-спектроскопии.

Несомненно, наиболее интенсивный пик РРА соответствует расстояниям медь(П) -экваториальные атомы кислорода и азота. Второй пик, расположенный на расстоянии 2,56 А соответствует расстоянию между центральным атомом и донорными атомами кислорода, находящимися в аксиальном положении. Следует отметить, что для комплекса II отмечается увеличение и уменьшение сравнительно с комплексом I. В

комплексе II не обнаруживается характерное для комплекса I расстояние RCu-N = 2.25 А.

Для установления природы атомов окружающих Cu(II) на расстоянии соответствующем третьему пику на F(R) при R = 3,19 А, нами был использован методический прием, предложенный ранее [19]. Известно, что при смещении нижнего

предела интегрирования интервала радиальной структурной функции Х(К) в направлении увеличения значений волновых векторов (К) на F(R) быстро уменьшаются амплитуды максимумов, соответствующих расстояниям до легких атомов (в нашем случае, атомов азота и кислорода). При этом, амплитуды максимумов, соответствующих расстояниям до тяжелых атомов, изменяются незначительно. В нашем случае при увеличении нижнего предела интегрирования, амплитуды всех структурных максимумов, кроме указанного, уменьшились. Так как полученные нами данные позволяют исключить присутствие атома




Рис.3. Кривая радиального распределения атомов в комплексе II .

хлора вблизи Cu(II), а соотношение Cu(II): фосфат ДНК, в данном случае, равное 1:12, исключает возможность близкого расположения атомов меди, то единственно верным отнесением пика является расстояние Cu-P.

Данные EXAFS спектроскопии, полученные при исследовании комплекса Ca(II) ДНК в работе Скуратовского И.Я. и др. [20], дают близкие значения расстояния катион-фосфат R Ca-P 3,03 А.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что донорный атом кислорода фосфатной группы ДНК находится в плоскости центрального атома.

Нами проведена грубая оценка параметра ковалентности а2, характеризующего a -связь иона меди (II) с донорными атомами в x-y плоскости в комплексах Cu(II) c нДНК. Величина a2 вычислена по формуле [ 21 ]:

a2 = A / P + ( g - 2,0023) + 3/7 ( gi - 2,0023 ) + 0,04,

где P = 0,036 см-1 для комплексов меди (II).

Приведенные в Табл! данные свидетельствуют о преимущественно ионном характере связи в полученных комплексах Cu(II) с нДНК. Таким образом, наши результаты дают основание полагать, что при взаимодействии иона Cu(II) с нДНК в растворах с высокой ионной силой ~ 0,25) образуются октаэдрические комплексы только с донорными атомами азота и кислорода фосфатной группы и молекул воды. Полученные данные позволяют исключить участие Cl- иона в образовании первых двух координационных сфер вокруг центрального атома в исследованных комплексах.



Ослабление связи N-Cu(II) в комплексе II, по сравнению с комплексом I, проявляется в низкочастотном сдвиге максимума поглощения в области d-d переходов комплекса II сравнительно с комплексом I.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акдокикашвили Э.Л. Биофизика, 1987, т.23, с.782

2. Marshall L.E., Graham D.R., Reich K.A., Sigman D.S. Biochemistry, 1981, V.20, №2, p.244-250.

3. Richard H., Scereiber J.B. Biopolymers, 1973, V.12, №1, p.1.

4. Forster W., Bauer E., Shutz H. et. al. Biopolymers, 1979, V.18, p.625.

5. Сорокин В. А. Биофизика, 1994, т.39, в.6, с.393.

6. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О. и др. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наукова думка, 1991. 270с.

7. Sorokin V.A., Blagoi Yu.P., Valeev V.A. et. al. J. Inorg. Biochem., 1987, v.30, №1,

p.87.

8. Bauchspiess K.R. A study of the pressure-induced mixed-valence transition in SmSe and SmS by x-ray absorption spectroscopy. Simon Fraser University, Aug. 1990,

Ph.D. Thesis, 327 p.

9. Андреев С.Н., Сапожникова О.В. Журн. неорг. химии, 1965, т.10, в.11, с.2538.

10. Вишневская Г.П., Каримова А.Ф. сб. Радиоспектроскопия. М.:Наука, 1973,

с.136.

11. Сухоруков Б.И., Козлова Л.А., Шабаргина Л.И. Биофизика, 1974, т.19, в.6,

с.963.

12. Kulikov A.P., Yuriev G.S., Babiy A.P. Nucl. Instrum. & Meth. In Phys. Res., 1987, v.A261, p.185-186.

13. Вашман А.А., Верещагина Т.Я., Пронин Н.С. Журн. структ. химии, 1970, т.11,

№3, с.433.

14. Молочников Л.С., Ильичев С.А., Балакин С.М. и др. Коорд. химия, 1988, т.14, в.10, с.1345.

15. Вишневская Г.П., Молочников Л.С., Сафин Р.Ш., Балакин С.М. Высокомолекулярные соединения, 1982, т.24, №3, с.611.

16. Волченскова И.И. Теор. и эксперим. химия, 1973, т.9, №5, с.627.

17. Спектроскопические методы в химии комплексных соединений (под ред. Вдовенко В.М.) М.-Л., Химия, 1964.



18. Бальхаузен К. Введение в теорию поля лигандов, М., Мир,1969.

19. Teo B.K. EXAFS: basis principles and data analysis, Berlin, N-Y, Springer Verlag, 1986, p.349.

20. Skuratovskii I. Ya., Hasnain S.S., Alexeev D.G. et. al. J. Inorg. Biochem., 1987,

V.29, p.249.

21. Kivelson D., Neiman R. J. Chem. Phys., 1961, V.45, p.149.



© 2017 РубинГудс.
Копирование запрещено.